单分子荧光检测系统的搭建及蛋白相互作用动力学的研究-光学工程专业论文.docx

The setup of double-channel single molecule fluorescence microscope and the dynamics study of protein interaction A Dissertation Submitted to The Graduate School of Henan University In Partial Fulfillment of the Requirements For the Degree of Master of Engineering By Aiyu Guo Supervisor: Professor Lijun Guo School of Physics and Electronics Henan University May 2015 关于学位论文独立完成和内容创新的声明 本人向河南大学提出硕士学位申请。本人郑重声明：所呈交的学位论文是 本人在导师的指导下独立完成的，对所研究的课题有新的见解。据我所知，除 文中特别加以说明、标注和致谢的地方外，论文中不包括其他人已经发表或撰 写过的科研成果，也不包括其他人为获得任何教育、科研机构的学位或证书而 使用过的材料。与我一同工作的同事对本研究所做的任何贡献均已在论文中作 了明确的说明并表示了谢意。 学位申请人（学位论文作者）签名： 20 年 月 日 关于学位论文著作权使用授权书 本人经河南大学审核批准授予硕士学位。作为学位论文的作者，本人完全 了解并同意河南大学有关保留、使用学位论文的要求，即河南大学有权向国家 图书馆、科研信息机构、数据收集机构和办校图书馆等提供学位论文（纸质文 本和电子文本）以供公众检索、查阅。本人授权河南大学出于宣扬、展览学校 学术发展和进行学术交流等目的，可以采取影印、缩印、扫描和拷贝等复制手 段保存、汇编学位论文（纸质文本和电子文本）。 （涉及保密被容的学位论文在解密后适用于本授权书） 学位获得者（学位论文作者）签名： 20 年 月 日 学位论文指导老师签名： 20 年 月 日 摘 要 生命本质的科学研究和逐步探索对传统分析提出了新的要求，利用传统的分子群 体检测技术难以对复杂的生物学反应做出解释。单分子检测（SMD）则可以对体系 中的单个分子进行研究，通过分析其物理量随时间的变化关系，获得单个分子特性、 分布状态以及特定变化的过程等。单分子检测已经成为生物物理学、分子生物学、物 理化学、生物医学以及纳米材料与科学等许多科研领域的重要手段。目前，单分子荧 光光谱技术已被广泛的应用于观察核酸和蛋白质等大分子的动态相互作用、跟踪单个 粒子的微纳米级位移以及识别多亚基体系的旋转运动等动态过程，结合荧光共振能量 转移（FRET）技术则可以用来研究生物分子动力学构象变化和相互作用的动力学过 程。 蛋白-蛋白相互作用的研究对于揭示细胞的功能调控机制及疾病治疗等方面具有 重要的科学意义。但蛋白识别和分离过程中的构象变化多发生在秒、毫秒甚至微秒时 域，且表现为时间和空间上的动态学不均匀性。本论文以自行搭建的单分子双通道全 内反射荧光显微(TIRFM)为主要研究手段、以植物谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)和硫氧 还蛋白(TRX)为研究体系，实时研究 GPX 和 TRX 的相互作用以及蛋白构象动力学在 其中的调控功能。具体工作如下： 1. 单分子荧光动力学测试系统的搭建：根据论文的工作设计和安排，我们自行设计 并搭建了双通道全内反射荧光显微镜系统，使其同时具有单分子 FRET 和单分子 跟踪及动力学分析的功能。论文详细介绍了该装置的搭建思路和过程，包括各个 仪器配件的选择和调试；通过对双荧光标记 DNA 的测试分析和检验，实现了整 个系统的性能优化，为之后在单分子水平上研究蛋白相互作用的动力学过程打下 了基础。 2. 拟南芥谷胱甘肽过氧化物酶（AtGPX3）和硫氧还蛋白（AtTRX9）的相互作用研 究：我们利用已经搭建的 TIRFM 系统，结合单分子荧光共振能量转移技术，以 拟南芥谷胱甘肽过氧化物酶（AtGPX3）和硫氧还蛋白（AtTRX9）为研究体系， 对 AtGPX3 和 AtTRX9 之间的蛋白相互作用过程进行了研究。在体相上，通过荧 光标记蛋白和荧光光谱技术，观测到了两种作用蛋白之间存在明显的 FRET 现象， 证实了 AtGPX3 和 AtTRX9 之间存在相互作用。在单分子水平上，利用 TIRFM 系统对标记后的 AtGPX3 和 AtTRX9 相互作用过程中供体和受体的强度变化进行 实时检测，并将计算所得的 smFRET 效率进行统计分析。结果发现，在两种蛋白 进行电子交换之后，二者之间的 FRET 效率呈现三种分布，特别是 FRET 效率从 最高到最低之间