脱氧核糖核酸蛋白质相互作用产物的检测及其在胃癌组织中的应用.docVIP

脱氧核糖核酸-蛋白质相互作用产物的检测及其在胃癌组织中的应用 建立了无胶筛分毛细管电泳?激光诱导 焚光(Non?gel sieving capillary electrophoresis with laser induced fluorescence, NGS?CE?LIF)检测脱氧核糖 核酸(DNA) ?蛋白质相互作用产物的方法。考察了筛 分介质聚环氧乙焼(Poly (ethylene oxide), PEO)浓 度、分离温度、分离电压及缓冲液三羟甲基氨基甲烷 硼酸(Tris?Borate?EDTA，TBE) pH 值等条件对 pUC19 DNA/Msp I (Hpa II) DNA Marker 和 Protein Molecular Weight Marker (Broad) D532S相互作用产物的影响。 结果表明，当PEO浓度为0.1%，TBE的pH为9.0,分 离电压为15 kV,分离柱温15 °C时，DNA?蛋白质相互 作用产物得到有效分离。本方法应用于人胃癌组织 P53基因扩增后的PCR产物和从相应组织中提取的蛋 白质二者相互作用产物时，检测效率高，分离效果好。 关键词脱氧核糖核酸；蛋白质；相互作用；无 胶筛分毛细管电泳；激光诱导荧光检测；聚环氧乙 烷；胃癌组织？ 1引言？ 蛋白质和核酸是构成生命体最为重要的两类生物 大分子，脱氧核糖核酸(DNA) ?蛋白质相互作用的研 宄是21世纪生命科学研究的主要课题之一，涉及多学 科前沿交叉领域的相关知识和技术方法。过去的研宄 主要集中在宏观认识方面，近年来，研究者综合各种 手段并采用先进的仪器在微观上取得一些可喜的成 果??[1,2]?，但目前仍处于探索阶段。弄清DNA?蛋白 质相互作用的机制，对于了解DNA转录调控和基因表 达机制，揭示各种生命活动现象具有极其重要的指导 作用。？ 采用无胶筛分毛细管电泳(Non?Gel sieving capillary electrophoresis, NGS?CE)分析核酸和蛋白质 已有报道??[3,4]?，但将其用于DNA?蛋白质相互作用 的研宄较少。研宄分子间相互作用是毛细管电泳 (Capillaryelectrophoresis, CE)的一个重要应用领域??[5?8]?，对于一个相互作用体系，只要游离配体 (或受体)和结合物之间存在荷质比的差异，理论上 讲，都可以在电场下将它们分离，而实际的分离效果 则取决于CE的模式、电场强度、温度、毛细管的内壁 状况等因素。在CE研究分子间相互作用中，最常用的 检测手段是紫外和激光诱导荧光(Laser induced fluorescence, LIF),激光诱导荧光通常要比紫外检测 的灵敏度高出10?1000倍，并且CE信号干扰低，但 需要进行荧光标记。研宄DNA?蛋白质相互作用的荧光 法，主要是将荧光物质修饰到蛋白质或核酸分子上构 成新型荧光标记物质并结合相关仪器而改造成新型的 检测技术，此法对待测物质的浓度要求低，灵敏度高 且部分荧光技术可实现对待测物质的动态分析等。 Wan等??[9]?利用毛细管电泳激光诱导焚光(CapHlary electrophoresis with laser induced fluorescence, CE?LIF) 技术研宄了单链DNA结合蛋白质的反应，CE?LIF结果 显示不同核苷酸标记的荧光探针因与蛋白质结合的强 弱不同，使得DNA?蛋白质复合物的计量系数不同，从 而得以区分。？ SYBR Green I和异硫氰酸焚光素(Fluorescein isothiocyanate, FITC)是两种常用的焚光衍生试剂， 前者常用于核酸的标记，后者则用于对蛋白质的标记。 本实验分别以二者为柱前衍生试剂，PEO为筛分介 质??[10]?，1XTBE为电泳缓冲溶液，对DNA和蛋白 质进行NGS?CE分析。以SYBR Green I标记DNA标准 物(pUC19 DNA/Msp I (Hpall) DNA Marker (26 ? 501 bp))和蛋白质标准物(Protein Molecular Weight Marker (Broad) D532S (6.5?200 kDa))共同孵育 后的混合物，以DNA和蛋白质标准物为材料，对DNA? 蛋白质相互作用产物的方法学及实验条件进行考察， 将其用于提取的胃癌组织基因和蛋白质相互作用产物 的检测，探讨DNA?蛋白质相互作用的机制，并以DNA 为“诱饵”，得到一种检测蛋白质的方便、有效、快速 的方法。 2实验部分？ 2.1仪器与试剂？ P/ACE System 5000型毛细管电泳仪（美国 Beckman公司），激光检测器波长为488 nm ;石英毛 细管柱（河北永年光导纤维厂）；P??H?S?3C型酸度