血浆HCY与其代谢酶基因多态性与神经管畸形的关系.pdfVIP

山西医科太学硕士学位论文 (7)Pucl9DNA／Msp(HpaII)Marker (本试验全部试剂购于上海生工) 2．2HeY检测主要试剂 同型半胱氨酸检测试剂盒：主要试剂如下 试剂l：S．腺苷甲硫氨酸(SAM) O．1mM NADH 0．2mM 三(2羧乙基)膦氯化氢(TCEP)0．5mM 伍一酮戊二酸 5．OmM 试剂2：Hey甲基转移酶(HMTase) 5．OKU，L 谷氨酸脱氢酶(GLDH) 10．OKU几 3．0KU／L 试剂3：S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(SAHasO 腺苷脱胺酶(ADA) 5．OKU几 (购于北京九强公司) 2．3主要仪器 PCR热循环仪 凝胶电泳成像系统 电泳仪 水浴锅 高速离心机 全自动生化分析仪 3实验方法 3．1PCR--RFLP法 模板的制备： 采用常规酚氯仿法提取基因组DNA：取患者及健康对照者5ml抗凝外周血(3．8％枸 PH8．0，15mmol／L DETA，15mmol／LNaCL)，蛋白酶K 100ul，55。C水浴中消化 5．Oul(25mg／m1)，10％SDS 直至白细胞团块充分消化后(约4小时)，用常规酚／氯仿抽提，即先加等体积Tris．HCL饱 和酚混匀后室温下5000 rpm／min，离心15分钟，将上层液移至一新管中，加入1／2体积饱 后将上层液移至无菌烧杯中，加3．5倍体积的冰冻无水乙醇轻轻摇晃至析出白色絮状物即 室温干燥，加适量TE(10mmol／LTris．HCL，1nunol／LDETAPH7．5)溶解，用惠普8452Ao 山西医科丈学磺士学位论文 紫外分光光度计测OD值后，．200C冰箱保存备用。 因型。 PCR反应扩增目的基因片段： 各多态性基因位点25．0p驴CR反应体系： MTHFR677MTHFRl298MTRR66 无菌去离子水 20．1山 20．1山 20．2阻 lO×dNTP(10Mm)1．O皿 1．O}d 1，0m 2．53 2．53 2．53 10×Buffer(含Mg”、 混合引物 0．43 0．43 O．33 基因组DNA 1．0皿 1．0m 1．03 仪即可进行扩增。 PCR反应条件 l、MTHFR677 60℃退火35s，72℃延伸45S，36个循环后，72℃延伸5min。 2、MTHFRl298 DNA聚合酶1．5U，94。C变性30s， 95。C变性5分钟，加入Taq 62℃退火25S，72℃延伸60S，30个循环后，72℃延伸5min。 3、MTRR66 DNA聚合酶1．5U，94C变性45s， 95℃变性5分钟，