低剂量亚砷酸钠致HBE细胞恶性转化过程中Keap1Nrf2-ARE信号通路的作用-卫生毒理学专业论文.docx

低剂量亚砷酸钠致 HBE 低剂量亚砷酸钠致 HBE 细胞恶性转化过程中 Keap1/Nrf2-ARE 信号通路的作用 中文摘要 I I PAGE IV PAGE IV 低剂量亚砷酸钠致 HBE 细胞恶性转化过程中 Keap1/Nrf2-ARE 信号通路的作用 中文摘要 目的 探讨低剂量亚砷酸钠致人支气管上皮（human bronchial epithelial，HBE）细胞恶 性转化过程中，细胞氧化还原状态变化情况及 Keap1/Nrf2-ARE 抗氧化信号通路相关 基因表达动态变化趋势，为阐明砷致癌作用的分子机制开辟新的研究途径。 方法 1.HBE 细胞恶性转化鉴定 用 1 μmol/L 亚砷酸钠连续染毒 HBE 细胞，同时设立传代对照组。通过形态学观 察、细胞计数法检测生长动力学改变、Elisa 法检测基质金属蛋白酶-9（MMP-9）以 及软琼脂克隆实验鉴定细胞恶性转化情况。 2.HBE 细胞恶性转化过程中 Keap1/Nrf2-ARE 信号通路相关指标表达检测 将 1 μmol/L 亚砷酸钠染毒组定义为染毒组，将代数匹配对照组定义为传代对照 组。建立低剂量亚砷酸钠致 HBE 细胞恶性转化模型后，分别于暴露 1、8、15、22、 29、36、43 代,以流式细胞仪检测细胞活性氧（ROS）水平，以硫代巴比妥酸（TBA） 比色法检测细胞丙二醛（MDA）含量，以 WST-1 法检测细胞超氧化物歧化酶（SOD） 活力，以 Western blot 方法检测 Keap1/Nrf2-ARE 抗氧化通路相关蛋白 Nrf2、Keap1 及下游基因 HO-1 蛋白表达情况。 3.T-HBE 细胞 Keap1/Nrf2-ARE 通路相关指标表达检测 将染砷组软琼脂克隆试验中阳性（≥30 个细胞）集落中单个克隆细胞挑出，继续 扩大培养，命名为恶性转化的 HBE 细胞（T-HBE Cells）。再次对 T-HBE 细胞、传代 对照 HBE 细胞通过上述实验检测 ROS、MDA、SOD、Nrf2、Keap1、HO-1 表达情况。 4.转录因子 Nrf2 对亚砷酸钠致 HBE 细胞恶性转化的影响 根据上述实验结果，对 T-HBE 细胞的 Nrf2 基因进行 siRNA 转染使其表达沉默， 中文摘要 低剂量亚砷酸钠致 HBE 细胞恶性转化过程中 Keap1/Nrf2-ARE 信号通路的作用 同时设立传代对照组、转染 Con siRNA 组及 T-HBE 组作为对照。用 Western blot 方法 检测 Nrf2 沉默情况，同时检测通路下游基因 HO-1 表达情况。沉默 Nrf2 表达后，分 别对 4 组细胞用 MTT 法检测细胞增殖情况，用划痕实验（Wound-healing cell migration assay）检测细胞迁移情况，用软琼脂克隆（Soft Agar）形成实验检测细胞锚着独立性 生长情况。 结果 1.HBE 细胞恶性转化鉴定 （1）与传代对照组 HBE 细胞相比较，染砷组细胞胞核与胞浆分界不清晰，胞浆 颜色变得更为浑浊，核仁数量明显增多，细胞边界不光滑，有褶皱，呈浸润型生长。 （2）分别取 29、36、43 代 HBE 细胞 104 个接种于 24 孔板中，于 24、48、72、 96、120h 后计数细胞，结果显示 36 代 HBE 细胞生长至 96h 和 120h 时，染砷组较传 代对照组细胞生长明显加快（p0.05），43 代细胞生长至 72h, 96h 和 120h 时，染砷组 较传代对照组细胞生长明显加快（p0.05）。43 代时，染砷组倍增时间（22.56±0.96 h) 较传代对照组细胞(31.41±3.78 h)明显缩短，差异具有统计学意义（p0.05）。 （3）分别取 29、36、43 代 HBE 细胞 2×104 个检测 MMP-9 分泌情况，结果显 示 36 代和 43 代染砷组 MMP-9 分泌量分别为[(2.651±0.246) ng/ml]、[(2.610±0.242) ng/ml] 均较传代对照组显著增多（p0.05）。 （4）43 代 HBE 细胞进行软琼脂克隆实验，结果显示染砷组 HBE 细胞集落数量 为[（273±90）个]明显高于传代对照组[（20±4）个]（p0.05）。 2.HBE 细胞恶性转化过程中 Keap1/Nrf2-ARE 信号通路相关指标表达变化 HBE 细胞染砷至 1、8、15、22、29、36、43 代，与正常对照（0 代）比较，22 代及以前 HBE 细胞内 ROS、MDA、SOD 水平均呈先升高后下降的波浪形趋势；29 代及以后，ROS、MDA 水平呈逐渐下降的过低表达状态，且以 ROS 表现更为明显， 而 SOD 水平在恶性转化后期呈逐渐升高趋势；全细胞、细胞核、