肺炎克雷伯氏菌的蛋白质组学分析-临床检验诊断学专业论文.docxVIP

4 数据采集 16 5 数据分析 16 5.1 ESBLs 菌株的蛋白质决策树诊断模型的建立 16 5.2 细菌蛋白质组学同源性分析 17 结 果 18 1 产 ESBLs 表型确证试验 18 2 肺炎克雷伯氏菌蛋白质指纹图 19 3 肺炎克雷伯氏菌产 ESBLs 菌蛋白决策树诊断模型 21 4 聚类分析 24 4.1 聚类方法 24 4.2 32 株产 ESBLs 细菌聚类分析结果 26 4.3 49 株肺炎克雷伯氏菌聚类分析结果 27 讨 论 31 1 ESBLs 菌株检测方法及产 ESBLs 细菌的防治 31 2 细菌同源性分析的方法 32 3 蛋白组学鉴定细菌感染的同源性 34 结 论 36 致谢 41 缩略语名词对照 42 综述 44 3 PAGE PAGE 10 肺炎克雷伯氏菌的蛋白质组学分析 摘 要 目 的 ： 利用 表 面 增 强 激 光 解 析 离 子 化 飞 行 时 间 质 谱 技 术 （SELDI-TOF-MS）检测临床感染的肺炎克雷伯氏菌蛋白质谱，对所得质 谱数据进行决策树诊断和聚类分析，为肺炎克雷伯氏菌产超广谱β-内酰胺 酶（ESBLs）菌株的鉴定和细菌同源性分析寻求简便快速的实验方法。 方法：1. ESBLs 仪器初筛实验（screening test）：使用 walkaway-96 全 自动细菌药敏鉴定仪对临床分离的肺炎克雷伯氏菌进行 20 种常见抗生素 敏感实验，凡头孢他啶、头孢噻肟、头孢曲松、氨曲南、头孢泊肟中有三 种或三种以上显示耐药，仪器提示这些细菌为产 ESBLs 可疑菌株，应进一 步做 ESBLs 确证实验。2. ESBLs 表型确证实验(confirmatory test)：对初筛 可疑产 ESBLs 菌株采用抗菌药物头孢他啶/克拉维酸（30μg /10μg）与头孢 他啶抑菌圈差值，头孢噻肟/克拉维酸（30μg/10μg）与头孢噻肟抑菌圈直 径差值来判断,当二种抗菌素中任何一种加克拉维酸后抑菌圈直径与不加 克拉维酸的抑菌圈相比，增大值≥5mm 时，判定为 ESBLs 阳性。以上两种 试验均用肺炎克雷伯氏菌 ATCC700603 做质量控制。3.细菌蛋白质谱分析 对确证产 ESBLs 的菌株和不产 ESBLs 的肺炎克雷伯氏菌通过先破坏细菌、 提取蛋白质，再用 SELDI-TOF-MS 技术及 Au 蛋白芯片自动检测细菌蛋白 质指纹图谱。4.数据分析 对检测的细菌蛋白质图谱用 Biomarker Wizard 3.1 软件进行分析，筛选肺炎克雷伯氏菌 ESBLs 阳性菌株和 ESBLs 阴性菌株 相关差异表达蛋白，建立肺炎克雷伯氏菌 ESBLs 阳性菌株决策树诊断模 型；用 SPSS 对肺炎克雷伯氏菌进行聚类分析，追溯其临床感染的同源性。 结果：1.对 walkaway-96 仪器初筛产 ESBLs 的 33 株肺炎克雷伯氏菌通 过纸片法表型确证实验确证有 32 株细菌 ESBLs 阳性（准确率为 96.97%）， 这些 ESBLs 阳性菌株主要分离自痰，其次是尿，患者以新生儿和 60 岁以 上的老年人为主。2. 32 株确证产 ESBLs 和 17 株不产 ESBLs 的肺炎克雷伯 氏菌在相对分子量为 2000-20000 范围内共检测到 47 个蛋白质峰，产酶株 和不产酶株有显著性差异的蛋白峰共 11 个（P〈0.01）。3. 用三个质荷比 分别为 5993.25，8363.60，9215.26 的蛋白质峰建立的肺炎克雷伯氏菌产 ESBLs 菌株决策树诊断模型能够区分肺炎克雷伯氏菌产酶菌株和不产酶菌 株，测试组准确率为 100%，验证组准确率为 90.90%。4. 32 株确证产 ESBLs 肺炎克雷伯氏菌质谱指纹图通过聚类分析，结果在差异水平为 10 的情况下 分为五型（A 型、B 型、C 型、D 型、E 型），以 B 型为主，A 型次之,再其 次是 C 型和 E 型，D 型最少，每型又分为 2-3 个亚型。 结论： 1.肺炎克雷伯氏菌产 ESBLs 菌株有其特征性的蛋白质谱指纹图。 2.筛选出的特征性蛋白质组（质荷比为 5993.25，8363.60，9215.26） 建立的决策树诊断模型能够区分肺炎克雷伯氏菌 ESBLs 阳性菌株和 ESBLs 阴性菌株，从而快速指导临床用药的治疗决策。 3.肺炎克雷伯氏菌聚类分析结果与临床病人临床信息，是否产酶及药 敏信息等基本一致，通过菌体蛋白质的分析能够有助于肺炎克雷伯氏菌临 床感染的同源性判断。蛋白质组学方法，在细菌感染的同源性分析方面具 有一定价值，值得进一步深人研究并用基因分析或氨基酸序列分析进行验 证。 关键词：肺炎克雷伯氏菌；蛋白质组；SEL