蛋白激酶C活性变化对adipophilin介导脂质蓄积的影响-病理学与病理生理学专业论文.docxVIP

PAGE PAGE 10 蛋白激酶 C 活性变化对 adipophilin 介导脂质蓄积的影响 研 究 生： 王中群 导 师： 袁中华 副教授 专 业： 病理学与病理生理学 中文摘要 胆固醇等中性脂质的蓄积是动脉粥样硬化泡沫细胞形成和四期病变发生的核心 环节。在真核细胞中，这些蓄积的脂质主要以脂滴的形式贮存于胞浆中。Adipophilin 就是脂滴外周 40 余种相关蛋白中含量最高的一种。其功能主要是促进细胞中脂质的 蓄积，抑制胆固醇的外流。在 adipophilin 基因启动子区有过氧化物酶体增殖物激活受 体 PPAR 各亚型的反应元件 PPRE，能够与 PPARγ1、PPARγ2 结合并调控人 adipophilin 基因的表达。而参与多种脂质代谢靶基因调控的核转录因子 PPARs 可以和转录共激 活物 PBP 作用，直接接受信号转导关键酶 PKC 的磷酸化调控。研究 adipophilin 在脂 质蓄积中的调控因素尤其是具有良好药物开发价值的 PKC 信号转导通路，有可能为 动脉粥样硬化性疾病的防治带来新的契机。本研究首先在动脉粥样硬化新西兰白兔模 型上观察 Adipophilin 和 PKCα的表达；然后在细胞水平上观察 oxLDL 对 A10 大鼠主 动脉平滑肌细胞、THP-1 人巨噬细胞和 ECV304 人脐静脉内皮细胞 PKC 活性和 PPAR γ与 Adipophilin 表达的影响；进一步应用 PKC 激动剂 PMA 和抑制剂 CalphostinC 观 察 PKC 活性的改变对荷脂 THP-1 巨噬细胞中 PKCα、PPARγ 和 Adipophilin 表达的影 响，并检测细胞内脂质蓄积的改变情况，以初步探讨信号转导途径中的关键酶 PKC 调控 adipophilin 及脂质蓄积的可能机制。 第一部分 动脉粥样硬化新西兰白兔 Adipophilin 和 PKCα表达的变化 目的 在动脉粥样硬化新西兰白兔动物模型上，观察 Adipophilin 和 PKCα表达的变化。 方法 采用本课题组建立的新西兰兔动脉粥样硬化动物模型。24 只新西兰白兔，随机 分为对照组和实验组。用高胆固醇饮食饲喂新西兰白兔 12w，动脉切片 HE 染 色；采用 Westernblot 蛋白印迹和免疫组化染色检测 Adipophilin 和 PKCα表达。 结果 喂养 12 周后颈总动脉放血处死动物，实验组新西兰白兔病变主动脉区可见内 膜增生、中膜增厚，脂质条纹突起,增生内膜内蓄积有大量的泡沫细胞。实验 组主动脉病变区 adipophilin 和 PKCα表达上调，与 adipophilin 阳性颗粒仅局限 于增生内膜不同，PKCα在内膜、近内膜的中膜区均呈强阳性表达。 结论 动脉粥样硬化新西兰白兔主动脉明显增厚，病变区 Adipophilin, PKCα表达上 调。 第二部分 OxLDL 对 A10、THP-1 及 ECV304 三种细胞 PKC 活性和巨噬细胞 PPARγ与 Adipophilin 表达的影响 目的 以 A10、THP-1 及 ECV304 三种细胞为研究对象，观察氧化型低密度脂蛋白对三 种细胞 PKC 活性和 PPARγ与 Adipophilin 表达的影响。 方法 用 0，10，20，40，80μg/ml oxLDL 共孵育 24h，PepTag? 非放射性蛋白激酶检 测法对荷脂细胞胞膜中 PKC 活性进行定性定量检测琼脂糖凝胶电泳分离磷 酸化条带，观察活性变化的趋势，紫外/可见分光光度计检测 570nm 吸光度， 定量酶的绝对活性；半定量 RT-PCR 和 Westernblot 检测 adipophilin、PPARγ和 α 亚型 PKC 表达的变化情况；油红 O 染色观察细胞内脂质蓄积情况。 结果 随着 oxLDL 浓度的增加，A10 细胞膜 PKC 活性从静息状态的 0.2613± 0.0521units/ml 陡增至 0.7685±0.0869units/ml；THP-1 巨噬细胞由 0.0670 ±0.0091units/ml 增至 0.1357±0.0235units/ml；ECV304 内皮细胞由 0.0550 ±0.0075units/ml 增至 0.1216±0.0187units/ml，其中平滑肌细胞膜活性增 幅最大 。 RT-PCR 和 Westernblot 检测显示平滑肌细胞和内皮细 胞不表达 adipophilin；随着氧化低密度脂蛋白浓度的增加，THP-1 巨噬细胞 adipophilin、 PPARγ和 α 亚型 PKC 表达明显增强。油红 O 染色显示细胞内脂滴增加，部分 融合成大脂滴。 结论 oxLDL 浓度依赖性的增强平滑肌细胞、巨噬细胞和内皮细胞的蛋