富硒酵母中硒的种态分析-生物化学与分子生物学专业论文.docx

II II 富硒酵母中硒的种态分析 专 业：生物化学与分子生物学 硕士学位申请者：蒲云霞 导 师：吴 刚 教 授 高愈希 研究员 中文摘要 硒（selenium，Se）是人体的必需微量营养元素，是1817年由瑞典化学家 J.J.Berzelius发现的，它是维持谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX ）活性的重要组 成成分。作为人体最重要的必需微量元素之一，硒在体内发挥着重要的生物学功 能，如抗氧化、增强免疫力、抗癌、抗衰老等作用。缺硒不仅导致多种疾病的发 生，如克山病、大骨节病等。而且还会影响心肌、肝脏、甲状腺等重要器官的正 常功能。硒在自然界中以无机硒和有机硒两种形式存在，无论是有机硒还是无机 硒都参与肝脏中的谷胱甘肽过氧化物酶的合成，发挥抗氧化作用。但无机硒毒性 大，生物利用率低；有机硒的毒性小、生物利用率高。近年来，富含有机硒的补 硒产品越来越受到研究者们的重视，如富硒酵母、富硒大蒜、富硒洋葱等。其中， 富硒酵母由于富含硒蛋白合成的前体—硒代甲硫氨酸（SeMet）而成为人与动物 常用的补硒产品，受到研究者的广泛关注。由于硒的生物利用率和毒性与它的化 学形态密切相关，因此，正确的评价富硒酵母中硒的存化学形态及其生物学作用 显得非常重要。近年来，发展了许多对富硒酵母中硒化物的提取、分离、鉴定技 术，如原子吸收光谱法（AAS）、原子荧光光谱法（AFS）、气相色谱法（GC）、 高效液相色谱法（HPLC）、质谱法（MS）等。 本文提出了一种新颖的、系统的、全面的对富硒酵母中硒化学种态的研究方 法。采用双向凝胶电泳与同步辐射 X 射线荧光(SRXRF)非在线（off line）联用技 术研究了富硒酵母中含硒蛋白的分布；对于富硒酵母中以小分子形态（Mr＜ 5KD）存在的硒化物研究，采用了非酶解法和酶解法（链蛋白酶 E）分别对水溶 性的硒化物及与蛋白质结合的硒化物进行提取，采用反相离子对色谱与电感耦合 等离子质谱在线（off-line）联用（RP-IP-HPLC-ICP-MS）技术，对两种小分子提 取物中硒的种类和化学形态进行了定性鉴定和定量检测。对富硒酵母中的总硒采 用电感耦合等离子质谱（ICP-MS）进行了定量检测。另外，采用一步增溶提取 法和顺序提取法对富硒酵母中高分子量的蛋白进行提取，并对蛋白的回收率进行 了比较。 III III 结果表明：ICP-MS 检测的富硒酵母的总硒浓度为 1411.42 ± 10.75μg g-1；一 步增溶蛋白提取液经双向电泳分离、考马斯亮蓝染色后，同步辐射 X 射线荧光 对凝胶上的蛋白质点进行扫描，共鉴定出 157 个含硒蛋白；对于富硒酵母中水溶 性和酶解的小分子（Mr﹤5KDa）提取物的分析结果表明：水溶性的小分子硒化 物中的硒占富硒酵母总硒的 15.1%，其中无机硒（SeIV， SeVI）只占 0.52%， 经差减法得出富硒酵母中 99%以上为有机硒。酶解法提取的小分子硒化物所含的 硒占总硒的 81.2%，硒代蛋氨酸（Se-Met）是主要存在形式，占总硒的 65.26%。 在富硒酵母中的一步增溶蛋白提取液和顺序蛋白提取液中，蛋白质的回收率分别 为 12.8%和 17.6%（酵母蛋白含量约占酵母细胞干重的 40%）。 本文对富硒酵母中硒的种态进行了系统的研究，为以富硒酵母作为硒源的补 硒产品的研究提供了很好的依据。 关键词：同步辐射 X 射线荧光；双向聚丙烯酰胺凝胶电泳；反相离子对色谱-电 感耦合等离子质谱；种态；硒；富硒酵母 PAGE PAGE IV Analysis of selenium speciation in selenium-enriched yeast Major： Biochemistry and molecular biology Candidate for M.A: Yunxia PU Directed by：Prof. WU Gang Prof. Yuxi Gao Abstract Selenium (Se) is an essential micronutrient element and has a major nutritional and biological role for living organisms. Se was discovered by chemistrist J. J. Berzelius, Sweden in 1817. It is component of the human enzyme glutathione peroxi- dase (GSH-Px). As a necessary nutritional element for organism, Se perform many important biochemical f