草坪草褐斑病菌粗毒素液对寄主叶片防御酶体系影响.docVIP

草坪草褐斑病菌粗毒素液对寄主叶片防御酶体系影响 　　摘要：分别利用草坪草褐斑病菌粗毒素5倍稀释液和10倍稀释液接种盆播坪草高羊茅，1周内逐天采集处理叶片，测定叶片防御酶(PAL,POD、PPO、CAT)活性变化。结果表明，坪草高羊茅叶片经粗毒素液处理1周内，PAL,POD、PPO活性较对照均有不同程度的提高，其总体变化趋势为先升高后降低，并且高浓度毒素处理较低浓度毒素处理的酶活性高，而经毒素处理后的坪草叶片CAT酶活性较对照却呈现下降的趋势。 　　关键词：草坪草褐斑病菌；粗毒素；防御酶 　　中图分类号：S436.8　文献标识号：A　文章编号：1001-4942(2012)01-0087-04 　　由丝核菌属(Rhizoctonia spp.)病原引起的草坪草褐斑病是世界上报道最早、分布最广、危害最重的草坪草病害之一。植株受害部位常为叶片、叶鞘和茎，发病初期，染病部位呈现梭形、长条形或不规则形水渍状病斑，后病斑中心枯白，边缘变褐，最后叶片干枯萎蔫。受害草坪初期常出现大小不等的近圆形枯草斑，条件适合时，病情快速蔓延，枯草斑直径从几厘米迅速扩大到2m左右，严重影响草坪的观赏价值和实用价值。 　　目前，有关草坪草褐斑病的研究大多集中于病害的识别、病原鉴定及防治药剂的筛选等研究，而对于病原菌与寄主之间互作的研究相对较少。大量研究表明，丝核菌的致病因子――毒素在致病过程中起重要作用，与寄主的致病力存在显著正相关，但报道多见于水稻等大田作物，而有关草坪草的研究尚未见相关报道。为进一步明确草坪草褐斑病病原的致病机理及病原与寄主的互作关系，本研究从病原菌代谢产物――毒素出发，研究不同浓度毒素处理对寄主体内防御酶体系的影响，明确寄主应对毒素所做出的生理反应，以期为病原菌的致病机理研究提供参考，并为病害的防治提供理论依据。 　　1.材料与方法 　　1.1供试材料 　　供试草坪草品种：高羊茅“火凤凰”。供试菌株：褐斑病病原RH2菌株，经鉴定为立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)。 　　1.2试验方法 　　1.2.1粗毒素液的制备将RH2菌株在PDA平板中扩大培养1周后，用直径0.5cm打孔器在菌落边缘打孔，挑取5块菌盘接种于150ml Ps液体培养基中，25℃静置培养20d。培养液2层滤纸过滤后，收集培养滤液。 　　培养滤液加入等体积乙酸乙酯萃取3次，萃取液经旋转蒸发去掉乙酸乙酯，残留的棕褐色物质即为粗毒素。由于乙酸乙酯对草坪叶片有轻微的毒性(经试验)，所以粗毒素用有机溶剂甲醇溶解。 　　1.2.2接种方法盆播苗出苗约1个月后接种。分别将粗毒素液稀释成5倍和10倍液作为接种体，甲醇为空白对照。分别将各接种体喷雾接种于叶片上，塑料薄膜保湿24h。试验共设3个处理，每处理重复3次。分别于接种后1、2、3、4、5、6d用灭菌剪刀剪下中上部叶片收集，各处理重复3次的叶片剪碎后混匀，冷冻保藏。 　　1.2.3酶粗提液的制备过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)、过氧化氢酶(CAT)提取：取采集叶片0.05g，放入研钵中，加入0.01g PVP，再加入0.05mol/L预冷的磷酸缓冲液(pH7.8)1.2ml，分3次加入，冰浴研磨成匀浆，将匀浆全部转入离心管中，4℃ 12000 r/min冷冻离心30min，上清液即为酶粗提取液。 　　苯丙氨酸解氨酶(PAL)提取：取采集叶片0.05g，放入研钵中，加入0.01g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，再加入5mmol/L巯基乙醇硼酸缓冲液(pH8.8)1.2ml，分3次加入，冰浴研磨成匀浆，将匀浆全部转入离心管中，4℃ 12000r/min冷冻离心30min，上清液即为酶粗提取液。 　　1.2.4酶活性测定 　　(1)PAL活性测定 　　反应体系为：0.1mol/L、pH 8.8的硼酸缓冲液2ml，0.02mol/L的L-苯丙氨酸1ml，酶液0.6ml。将测定管放在30℃恒温水浴锅中保温45min，取出立即加入6mol/L的盐酸1.0ml终止反应，测定290nm处的吸光值。空白对照以缓冲液代替酶液，每样品重复3次，以每分钟OD290变化0.01为一个酶活单位。 　　(2)POD活性测定 　　反应体系为：pH7.8磷酸缓冲液2.9ml，2％过氧化氢(现用现配)1.0ml，0.05mol/L愈创木酚1.0ml，酶液0.08ml，反应体系加入酶液后混匀测定OD470，每1min读数1次，读3min内的变化值，空白对照以缓冲液代替酶液，每样品重复3次，以每分钟OD470变化0.01为一个酶活单位。 　　(3)PPO活性测定 　　反应体系为：pH 7.8磷酸缓冲液2.0ml，0.1mol/L邻苯二酚1ml，酶液0.5ml，反应体系加入酶液后在37℃恒温水浴锅中保温1h，取出