ＢＣＩ－２环状结构域对ＢＣＩ－２蛋白结构影响　　.docVIP

ＢＣＩ－２环状结构域对ＢＣＩ－２蛋白结构影响　　 　　孙志扬 刘　娜 李　杨 宋海燕 　　 　　[摘要]　目的　探讨BCI-2 Ioop domain环状结构域安全检查突变对Bel-2蛋白结构的影响。方法在同济大学附属东方医院细胞治疗室分别对BCI-2 Loop domain结构域的55和70位氨基酸行点突变及对BCI-2 Loop domain结构域行缺失突变并应用PCR及Western blot方法检测BCI-2 Loop domain结构域突变前后BCI-2蛋白的表达变化。结果对BCI-2 Loop domain结构域的55和70位氨基酸进行点突变组，BCI-2蛋白在上清中和沉淀中均能检测到，对BCI-2 Loop domain结构域行缺失突变组BCI-2蛋白只在沉淀中表达，在上清中未检测到。结论BCI-2 Loop domain结构域在BCI-2蛋白结构中起到重要作用。 　　[关键词]B细胞淋巴瘤／白血病基因2；环状结构域；基因突变 　　细胞凋亡是指细胞在发育一定阶段出现的正常的选择性死亡现象，其启动和进程受一定程序的控制，故也称程序性细胞死亡。过度凋亡与神经退行性疾病等有关，而凋亡受到抑制则与肿瘤等疾病的产生有关。此外，在创伤、神经功能修复领域的凋亡研究也成为当代学者研究的热点。B细胞淋巴瘤／白血病基因2(B cell lmaphoma／leukemia-2，BCI-2)在细胞凋亡通路中起着重要的调节作用，但BCI-2蛋白的结构及其抑制凋亡的确切机制不清，x－行射和核磁共振研究表明，BCl－2家族蛋白的三维结构含有2个中心疏水a螺旋，外绕5个两性螺旋，它 　　基金项目：国家自然科学基金资助项目(No 　　作者单位：200120上海，同济大学附属东方医院急诊创伤医学科(孙志扬、刘娜)，细胞治疗科(李杨、宋海燕) 通讯作者：孙志扬，Emial：dfsunzy@126．com们之间由60个残基环状结构域(100p domain)连接。loop domain是否是BCI-2蛋白的重要功能结构域尚未被证实。本研究拟通过基因突变及免疫印迹等方法初步探讨BCl一2 Loop domain结构域突变对Bcl－2蛋白结构的影响，为肿瘤、创伤、神经功能修复等疾病研究提供新靶点。 　　 　　1　材料与方法 　　 　　1.1 材料 　　pET41a(+)真核表达载体(本院细胞治疗科)；L60细胞(上海中科院细胞生物所)；逆转录酶、Trizol、Taq酶、限制性内切酶NdeI和XholI、dNTP混合物、MarkerDL-2000、ECL化学发光试剂(上海晶美生物公司)；引物(上海生物工程有限公司合成)；DH5a感受态细胞、T4DNA连接酶(北京天为时代生物公司)；兔抗人BCI-2(N-19)单克隆抗体(美国，SANTA CRUZ公司)；二抗HRP标记的山羊抗兔IgG(美国，Sigma公司)。 　　 　　1.2构建BCI-2 cDNA的克隆 　　应用RT-PCR方法扩增人BCI-2基因，克隆的cDNA表达序列长度为720 bp。收集L60细胞，按106～107个细胞加入1.0 ml Trizol，加入2μl氯仿／异戊醇抽提总RNA，异丙醇沉淀RNA，DEPCH2O溶解。逆转录反应体系50μl，5μg总RNA，逆转录酶5U，42℃ 2h。以得到的cDNA为模板进行PCR扩增，引物序列Bcls：5’-GCC ATA TGGCGC ACG CTG GGA GAA-3’，Bclas：5’-GCG CTCGAG TCA CTIGTG GCC CAG ATA G-3’，反应体系50μl，其中20μmol／L BCI-2上、下游引物各1μl，5U／μl pymbest Taq酶2.5 u，反应条件95℃预变性2 min；94℃变性30s，58℃ 退火30s，72℃延伸50s，25个循环；72℃后延伸7min。 　　构建PET41a-BCI-2真核表达质粒。1.5％琼脂糖凝胶电泳观察，回收PCR产物。用Ndel和Xholl双酶切回收片段和真核表达载体pET41a(+)。反应体系40，37℃2 h，酶切后电泳分离，回收目的片段。连接载体和BCI-2编码序列，连接反应体系20μl，T4 DNA Ligase 2.5μl，4℃连接过夜。连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，铺板37℃培养过夜，挑单克隆抽提质粒，Ndel和Xholl双酶切鉴定，并送TaKaRa公司测序鉴定。 　　 　　1.3构建BCI-2 Loop domain 55和70位氨基酸点突变克隆 　　PCR扩增在突变位点附近设计引物，在引物上引入突变，并进行PCR扩增，将两个片段进行拼接。得到含有突变位点的全长片段后构建到pET41a(+)载体上