高强度聚焦超声对溶菌酶结构、活性的影响-生物医学工程专业论文.docxVIP

重庆医 重庆医科大学硕士研究生学位论文 万方数据 万方数据 英汉缩略语名词对照 英文缩写 英文全称 中文全称 HIFU High intensity focused ultrasound 高强度聚焦超声 1H-NMR Nuclear Magnetic Resonance Spectrum 核磁共振氢谱 SDS Polyacrylamide gel electrophoresis 聚丙烯酰胺凝胶电泳 LYZ Lysozyme 溶菌酶 Trp Tryptophan 色氨酸 PCD Passive Cavitation Detection 被动空化检测 RMS Root Mean Square 均方根 FFT Fast Fourier Transformation 快速傅里叶变换 1 高强度聚焦超声对溶菌酶结构、活性影响 摘 要 研究背景 高强度聚焦超声（High intensity focused ultrasound，HIFU）是一种 新型的微无创治疗技术，已在临床应用中展现出巨大的优势。HIFU 治 疗的主要作用机制包括热效应、机械效应以及空化效应等。目前，关 于 HIFU 对蛋白质结构、活性的影响的报道少之又少。因此，本文使用 溶菌酶作为研究蛋白，利用质谱、圆二色光谱（CD 光谱）、荧光光谱、 核磁共振氢谱(1H-NMR)、聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS)以及被动空 化检测（Passive Cavitation Detection PCD）等方法，研究了 HIFU 处理 溶菌酶后对溶菌酶结构、活性的影响，并初步探讨了 HIFU 影响蛋白质 结构、活性的作用机制。 目的 1. 探讨高强度聚焦超声对一种蛋白质—溶菌酶结构、活性的影响， 以及相应的辐照参数。 2. 从声空化和温升的角度探讨高强度聚焦超声对溶菌酶结构、活性 影响的机制。 方法 1. 分别使用频率 0.94 MHz、声功率 500W、脉冲重复频率 4 Hz、 占空比 10%的脉冲高强度聚焦超声辐照溶菌酶溶液 10 s、 2 2min、3min、4min、5min。以及使用频率 0.94 MHz、声功率 分别为 100W、200W、300W、400W、500W，脉冲重复频率 4 Hz、占空比 10%的脉冲高强度聚焦超声辐照溶菌酶溶液 5min。4oC 保存备用。 2. 利用质谱、圆二色光谱（CD 光谱）、荧光光谱、核磁共振氢 谱(1H-NMR)和聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS)方法，研究高 强度聚焦超声对溶菌酶结构的影响。采用溶菌酶试剂盒测定辐 照前后溶菌酶活性的变化情况。 3. 采用 PCD 系统采集 HIFU 辐照过程中焦域处的声发射信号 （acoustic emissions，主要为空化信号），对该信号进行快速傅 立叶变换（Fast Fourier Transformation，FFT）然后进行带通滤 波（3~7MHz）后用带阻滤波器滤除通带内的谐波（3f0、4f0、 5f0、6f0、7f0），得到非谐波的宽带噪声，然后对宽带噪声进行 均方根（Root Mean Square，RMS）运算，得到 RMS 随辐照 时间的变化曲线。进而得到 辐照过程中的累积空化剂量 （ICD）。 4. 使用温度采集系统记录 HIFU 辐照中焦域处的温度，并绘制其 随辐照时间变化的曲线。 结果 1. 高强度聚焦超声处理后，质谱无明显变化，表明超声对溶菌酶 一级结构无影响；CD 光谱无明显变化，表明超声对溶菌酶二 级结构无影响；而荧光光谱显示，荧光强度减弱，且荧光强度 3 随着 HIFU 辐照功率、辐照时间的增加逐渐减弱。说明溶菌酶 色氨酸（Trp）周围的疏水结构发生了变化，且随着 HIFU 辐 照功率、辐照时间的增加，疏水结构进一步被破坏；SDS结果显示，经超声辐照后溶菌酶出现支链降解，且随着 HIFU 辐照功率、辐照时间的增加，目标条带逐渐变细变淡；1H-NMR 结果显示，经超声辐照后溶菌酶色氨酸发生了化学位移，且随 着 HIFU 辐照功率、辐照时间的增加，化学位移也有所增加。 2. 高强度聚焦超声处理后，溶菌酶活性均出现降低现象。且随着 HIFU 辐照功率、辐照时间的增加，溶菌酶活性逐渐降低，由 最初的 200U/ml 下降到 23.2U/ml。 3. HIFU 辐照过程中，存在空化现象，且随着辐照功率的增加， 累积空化剂量随之增加，表现在溶菌酶结构方面的影响，色氨 酸荧光强度随之减弱，化学位移随之增加。表现在溶菌酶活性 方面的影响，溶菌酶的活性逐渐减弱。 4. HIFU 辐照过程中，焦域处温度变化幅值不大,初始温度 18oC， HIFU 辐照产生的最高温度为 23.3oC，其温度的变化不足以引 起溶菌酶变性。 结论 1、 实验结果表明高强度聚焦超声可以改变溶菌酶的