高蛋白海洋解脂耶罗维亚酵母遗传改良以及表达重组抗菌肽的研究-微生物学专业论文.docxVIP

高蛋白海洋解脂耶罗维亚酵母遗传改良以及表达重组 抗菌肽的研究 学位论文完成日期： 如11．弓 指导教师签字： 答辩委员会成员签字：   独 创 声 明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得 或 其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我～同工作的同志对本研究所做的 任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：王芳 签字日期：2111年与月髫日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人 授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权中国科学技术信息 研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并通过网络向社会公 学位论文作者签名： 王考 新粹扒 众提供信息服务。(保密的学位论文在解密后适用本授权书) 签字17 11：四fJ年岁月增同 一期驯、畛编   高蛋白海洋解脂耶罗维亚酵母遗传改良以及表达重组抗菌肽的研究 高蛋白海洋解脂耶罗维亚酵母遗传改良以及表达重组抗菌 肽的研究 摘 要 从分离白海水、海泥、海鱼肠道与海藻的78株海洋酵母中筛选出7株高蛋白 海洋酵母(hcx．2，L2．2，WI．6，Qme，SWJ．1b，W2B和Z172 1．2)，经测定 它们的粗蛋白含量都超过了40．0％(w／w)。其中菌株SWJ．1b蛋白含量最高，达到 47．6％(w／w)，其细胞量(g／L)为6．7，其可作为潜在的单细胞蛋白使用。菌株 SWJ．1b分离自鱼肠道。根据传统的鉴定方法、Biolog微生物自动分析系统鉴定及 分子生物学鉴定，菌株SWJ．1b最终被鉴定为解脂耶罗维亚酵母菌(Yarrowia lipolytica)。 利用表面展示系统对得到的高蛋白海洋y lipolytica菌株SWJ—lb进行了遗传 改造。编码增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的基因被插入表面展示质粒 pINAl317一YICWPl 10中，并在E lipolytica菌株SWJ—lb的尿嘧啶缺陷型中表达， EGFP被成功展示在酵母细胞表面，且发现1 00％的转化菌株细胞表面都展示有 此锚定的目标蛋白。对海洋酵母Y lipolytica SWJ．1b菌株，其尿嘧啶缺陷型菌株 22a．2和筛选出的展示有EGFP的阳性转化子106进行了粗蛋白含量、细胞量、 氨基酸含量、脂肪酸含量等营养组分分析，发现三者粗蛋白含量(w／w)分别为： 54．9士1．3％、54．9士1．6％、51．1 4-O．8％，细胞量(∥L)分别为：12．0 4-0．1、12．0 士0．2、16．0士O．1。三者氨基酸组分仍基本一致，特别是必需氨基酸，如赖氨酸、 甲硫氨酸和亮氨酸等。筛选的转化子106的C18l和C183脂肪酸含量高于野生型 SWJ．1b菌株，C16．o和C16Il脂肪酸含量低于SWJ．1b。表明海洋酵母SWJ．1b可经 过基因改良锚定外源蛋白而且仍可进一步作为单细胞蛋白使用。 将编码来自栉孔扇贝(Chlamysfarreri)组蛋白H2A N．端抗菌肽的DNA片 段连接到表达质粒pINAI 317中，在y：lipolytica SWJ．1b菌株中表达。在PBB培 养基中培养120h后，转化子YI—H2A．29a产生了较多的抗菌肽，获得的上清对哈 维氏弧菌、鳗弧菌和副溶血弧菌都具有抗菌活性。对三者最小抑菌浓度(I．tg of protein／mL)分别是4．47 4-0．4、8．95士1．4和1．12 4-0．2。对三者的抑菌圈直径  高蛋白海洋解脂耶罗维亚酵母遗传改良以及表达重组抗菌肽的研究 分别为：14．0 mill、11．0mm和24．0 ITUn。然而我们发现上清对革兰氏阳性菌大肠 杆菌、枯草杆菌和金黄色葡萄球菌均无抑菌活性。用Ni2+亲和层析纯化带有6× His标签的重组抗菌肽，纯化的重组抗菌肽分子量为4．5 kDa。透射电子显微镜观 察发现，利用抗菌肽处理副溶血弧菌完整细胞和原生质体细胞后，抗菌肽造成了 完整细胞和原生质体细胞的细胞内溶物泄露，并导致细胞死亡。这表明抗菌肽能 够通过细胞外基质或细菌脂多糖、外膜和肽聚糖等不同屏障，在细胞膜上形成孔 洞。SWISS模型分析表明抗菌肽中具有Ot螺旋结构，抗菌肽氨基酸的疏水性分 布表明抗菌肽具有很多疏水性氨基酸，这可能和抗菌肽的抑菌活性机制相关。将 已证实成功表达了抗菌肽基因的酵母转化子YI．H2A一29a培养在YPD培养基， PPB培养基和含有硫酸铵的豆