高赖氨酸蛋白基因转化银耳分析-蔬菜学专业论文.docxVIP

福建农林大学硕士学住论文 福建农林大学硕士学住论文 中文摘要 中文摘要 蛋白质是人的营养要素，它由20多种氨基酸组成，其中有10种氨基酸 人不能合成，只能从食物中摄取，称之为必需氨基酸。赖氨酸是十种必需 氨基酸之一，赖氨酸具有多种生物学功能，这些功能包括：增进食欲、提 高血液中血红蛋白含量：赖氨酸铝盐可治胃溃疡等。人体缺少赖氨酸会出 现体重轻、骨骼发育不全、也会降低人体对其它氨基酸的吸收，营养学家 把它称为“第一缺乏氨基酸”。 赖氨酸蛋白基因转入具有较高食药用价值的银耳，合成具有生物活性 的赖氨酸蛋白，相当于在营养丰富的银耳中添加新的营养保健因子，既提 高银耳的营养保健价值，又增加人体对膳食中蛋白质的利用率。 本研究在探索银耳遗传转化体系的基础上，构建了高赖氨酸蛋白基因 表达载体，利用限制性内切酶介导整合法(R E M I)，首次把高赖氨酸 蛋白基因导入银耳芽孢，获得了转基因菌株。对转基因菌株进行分子检测， 证实了外源基因已整合到银耳基因组中。氨基酸含量测定表明，转基因银 耳中赖氨酸含量得到不同程度的提高。具体结果如下： 1．银耳原生质体制备与再生条件优化 以芽孢、菌丝体和子实体为材料，通过正交实验，考察了菌株、酶浓 度、酶解时间以及酶解温度对原生质体产率和再生率的影响，结果显示： 实验材料对原生质体产量影响最大，以芽孢为材料原生质体产量可达到 2．75×107个／ml，而菌丝体和子实体的原生质体产量仅为2．5 X 106个／ml 和1．0X 106个／ml；在35。C下酶解，原生质体产量最高；溶壁酶浓度在1％～ 3％之间对原生质体产量影响不大；不同菌株原生质体产量差异不显著。本 实验还研究了稳渗剂浓度对原生质体再生率的影n向’结果表明，0．5 mol／L～0．7 mol／L的KC]对原生质体再生没有显著差异，再生率最高为 32．3％。 2．营养缺陷型菌株的筛选 福建农林欠学硕士学位论文 福建农林欠学硕士学位论文 中文摘要 对比紫外线与y射线对银耳芽孢的诱变效应，Y射线诱变获得了48 个缺陷型菌株，经传代后都被修复，没有获得稳定的突变体，紫外线诱变 后有62个缺陷型菌株，经过传代后获得2株稳定的缺陷型突变体，获得两 个营养缺陷型菌株，其中～株Tau81l经鉴定是肌醇缺陷型。突变体Tau811 的生长迟缓期比野生型多3天，生长速度较慢。 3．高赖氨酸蛋白基因转化银耳及分子检测 以pBR—lys为中间载体，把pBR—lys的Pubi启动子置换成P35S，构建成 表达载体pCB—lys。应用REMI介导转化银耳芽孢，获得众多的转化子，核 rDNA检测结果和营养缺陷型检验结果表明，这些转化子均是银耳芽孢。PCR 检测结果：转化子携带P35S启动子、Lys基因、GUS基因、hpt基因、Tnos 终止子。转基因银耳芽孢对潮霉素的抗性水平可达到150ug／ml以上，大部 分转化子检测到GUS活性。 4．转基因菌株赖氨酸含量测定 利用氨基酸自动分析仪，对潮霉素抗性较强的6个转基因菌株以及对 照Tau811进行氨基酸分析，结果显示：转基因菌株的赖氨酸含量都有不同 程度的提高，其中有4株提高了儿％以上，最高一株为16．57％，而且蛋白 质中氨基酸总量也有较大I瞩度的提高。 关键词：银耳，富含赖氨酸蛋白基因，遗传转化，赖氨酸含量 福建农林大学硕士学位论文ABSTRACT 福建农林大学硕士学位论文 ABSTRACT Protein iS nutrition to human beings．which consists of twenty difierent tyDes of amino acids，ten of which not be synthesized by human bodies thus have be taken from food．These types of amino acids are called essential amino acids．Lysine iS of nine essential amino acids． Lysine has many biological functions including：increasing the appetite； enhancing the hemoglobin content in blood and curing peptic ulcer’etc． The lack of iysinc in human being abnormal IOSS of weight