肝素对小鼠肝癌细胞hcaf和hcap淋巴道转移的抑制作用.docVIP

肝素对小鼠肝癌细胞Hca F和Hca P淋巴道转移的抑制 作用 姓 名： 2014年6月25日 肝素对小鼠肝癌细胞Hca F和Hca P淋巴道转移的抑制作用 ：王宏梅，魏巍，谢涛，康晓慧，左云飞，张嘉宁 目的观察肝素对小鼠肝癌高转移株Hca F和低转移株Hca P细 胞与冰冻淋巴结切片体外粘附和体内淋巴道转移的影响，探讨其作用的分子机 制。方法采用细胞黏附检测(Stamper Woodruff Method)、组织化学、流式细 胞分析等方法，观察和检测肿瘤细胞粘附和转移的情况。结果肝素体外对小鼠 肝癌细胞Hca F和Hca P与冰冻淋巴结切片粘附有明显的抑制作用，100U、 150U肝素组与对照组比较有高度统计学意义(P0.01)；肝素体内对小鼠肝癌 细胞Hca F淋巴道转移也有明显的抑制作用，100U肝素组与对照组比较有统 计学意义(P0.05)。结论小鼠肝癌细胞Hca F和Hca P均有L选择蛋白 的表达，仅程度不同，L选择蛋白的表达水平高低与Hca F和Hca P细胞的 淋巴道转移潜能正相关，肝素竞争性抑制L选择蛋白与其配体的结合过程，从 而达到抑制肿瘤细胞转移的目的，这可能是肝素抑制肿瘤及其转移作用的分子机 制之一，由此也说明L选择蛋白介导和协助了 Hca F和Hca P细胞的淋巴 道转移。 关键词 肝素；L选择蛋白；粘附；淋巴道转移 Hca F和Hca P是从小鼠腹水型肝癌细胞株H22中筛选岀的特异性向淋 巴道转移的细胞，Hca F为高转移细胞株，淋巴结转移率高于80%, Hca P 为低转移细胞株，淋巴结转移率低于30%。研允表明［1，2］，不同淋巴结转移能 力的Hca F和Hca P细胞中，Hca F细胞的L选择蛋白表达量明显高于 Hca P细胞，L选择蛋白可能介导和协助了 Hca F和Hca P细胞经淋巴道 的转移。实验表明［3］,肝素可以抑制L 、P选择蛋白与sLeX的结合，这提 示肝素可能是L选择蛋白配体的竞争物。本实验采用Hca F和Hca P细胞， 以615小鼠为研宄对象，观察不同浓度肝素对冰冻淋巴结切片体外粘附和体内淋 巴道转移抑制作用的影响。 1材料与方法 1.1材料 小鼠腹水型肝癌高低转移株细胞Hca F和Hca P，由大连医科大学病理 教研室克隆并冻存。615小鼠，普通级，8周龄，雄性，体重20?23g，由大连 医科大学动物中心繁育提供，动物合格证号SCXK （辽）2002-0002。肝素钠 （150U/mg,进口分装，上海生物所）；RPMI1640完全培养液（HyClone公司）; 新生小牛血清（中美合资兰州民海生物工程有限公司）；青链霉素（GIBCO/BRL 公司）；CFSE （Fluka公司）。CO2恒温细胞培养箱（美国，HEPA公司）；普通 显微镜（闩本，Olympus公司）；倒置显微镜（円本，Nikon公司）；THZ C恒 温振荡器（江苏省太仓市实验设备厂）；流式细胞仪（美国，BD公司）；石蜡切 片机（德国）；恒温冷冻切片机（英国）。 1.2方法 1.2.1细胞培养分别复苏Hca F和Hca P细胞，接种至正常615小 鼠腹腔，7天后无菌条件下抽取腹水，再次接种于正常615小鼠腹腔，5天后无 菌条件下抽取非血性腹水，以PBS缓冲液洗涤1次，将细胞加入含10%火活的 小牛血清、RPMI1640完全培养液中（含青霉素100U/ml，链霉素100 |ig/ml）, 培养24h以使巨噬细胞贴壁，收集悬浮液，离心收集细胞。 1.2.2 体外粘附抑制实验（Stamper Woodruff Method）配制终浓度为 50U、100U、150U不同肝素浓度细胞悬液（2xl05/ml），不加肝素的细胞悬液做 对照，37°C温育lOmin。取正常615小鼠腹股沟、腋窝淋巴结做连续冰冻淋巴结 切片（厚7pn）,分别加入200（il不同肝素浓度的细胞悬液和对照液，37°C共温 育16h，取出后倒去剩余液体，加入生理盐水，轻轻晃动洗涤1次，置于7°C冰 箱30min，然后用冷生理盐水震荡洗漆（40r/min，lmin） 3次，洗去未黏附细胞。 95 %冷乙醇固定5min, HE染色（苏木素伊红染色，hematoxylin eosin staining）,观察细胞粘附部位及数量，随机计数5个低倍视野（100x）并照相保 存。实验重复六次。 1.2.3体内淋巴道转移抑制试验本实验分对照、100U肝素2组，每组 10只小鼠。分别制备Hca F和Hca P细胞悬液（6107/ml）,配制成100U肝 素浓度细胞悬液，生理盐水细胞悬液做对照，37°C温育lOmin。取50…（3x106 个细胞）细胞悬液正常615小鼠足垫注射，以后每隔3天100U肝素组足垫再 注射50 M1 100U肝素溶液，对照组再注射