基于GFP分子的抗体设计与改造-生物学;微生物学专业论文.docxVIP

CLC Code： Unit Code：10389 Secret Level： Student NO.：1110517005 The master’s thesis of Fujian Agriculture and Forestry University Design and modification of antibody based on GFP Discipline Category: Science Primary Subject: Biology Secondary Subject: Microbiology Research Field: Molecular Immunology Postgraduate: Shuangshuang Xiang Adviser: Prof. Shihua Wang Submitted Time: April, 2014 独创性声明 本人声明，所呈交的学位（毕业）论文，是本人在指导教师的指导下独立完 成的研究成果，并且是自己撰写的。尽我所知，除了文中作了标注和致谢中已作 了答谢的地方外，论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果。与我一同对本 研究做出贡献的同志，都在论文中作了明确的说明并表示了谢意，如被查有侵犯 他人知识产权的行为，由本人承担应有的责任。 学位（毕业）论文作者亲笔签名： 日期： 论文使用授权的说明 本人完全了解福建农林大学有关保留、使用学位（毕业）论文的规定，即学 校有权送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅; 学校可以公布论文的全部或 部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 保密，在 年后解密可适用本授权书。 □ 不保密，本论文属于不保密。 □ 学位（毕业）论文作者亲笔签名： 日期： 指导教师亲笔签名： 日期 目录 摘要 i Abstract ii 第一章 文献综述1 1. 抗体1 1.1 重组抗体技术 1 1.2 基因工程单链抗体（scFv） 2 1.3 scFv 抗体的产生 3 1.4 scFv 抗体片段的表达 3 1.5 scFv 的应用 5 HYPERLINK \l _TOC_250000 2. 绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein, GFP) 6 2.1 绿色荧光蛋白基本概述 6 2.2 绿色荧光蛋白结构特征 7 2.3 绿色荧光蛋白的应用 8 3. 本研究的目的和意义 10 第二章 基于 GFP 的 scFv 不同功能区插入体的原核表达与纯化 11 引言 11 材料与方法 11 1. 材料 11 1.1 质粒与菌株 11 1.2 试剂与耗材 12 2. 方法12 2.1 引物设计 12 2.2 质粒提取 12 2.3 PCR 扩增 12 2.4 PCR 产物的回收，酶切和连接 13 2.5 连接产物的转化 14 2.6 单克隆的验证 14 2.7 重组载体的诱导表达鉴定 14 2.8 目的蛋白的纯化 15 2.9 纯化蛋白浓度的标定 15 3．结果与分析 16 3.1 重组载体的构建 16 3.2 PCR 扩增基因 17 3.3 测序结果 18 3.4 蛋白的表达与纯化 20 4．讨论21 4.1 Loop 9 的选择 21 4.2 重组载体的构建 21 4.3 不同形式 scFv 片段的插入对 GFP 荧光活性的影响 21 4.4 可溶性分析 22 5. 小结22 第三章 scFv 抗体作用区的鉴定 23 I 引言23 材料与方法 23 1. 材料23 1.1 实验试剂和材料 23 2. 方法23 2.1 重组载体荧光强度的检测 23 2.2 蛋白浓度的测定 23 2.3 ELISA 检测抗体作用区 23 2.4 竞争 ELISA 24 2.5 ELISA 检测 scFv 关键作用区的特异性 24 3. 结果与分析 26 3.1 重组载体蛋白的荧光强度 26 3.2 抗体作用区的鉴定 26 3.3 竞争 ELISA 27 3.4 抗体作用区的特异性检测 28 4. 讨论29 4.1 重组载体荧光强度的差异和抗体作用区的鉴定 29 4.2 抗体特异性的鉴定 29 5. 小结29 第四章 scFv 不同 CDR 功能区的研究 30 引言30 材料与方法 30 1. 材料30 1.1 质粒与菌株 30 1.2 试剂与耗材 31 2. 方法31 2.1 引物设计 31 2.2 质粒提取 31 2.3 PCR 扩增 31 2.4 PCR 产物的回收，酶切和连接 32 2.5 连接产物的转化 32 2.6 单