基于fc融合蛋白细胞外基质的构建及其生物活性研究-生物化工专业论文.docxVIP

摘 要 生命体内庞大的血管网络为细胞供应充足的氧气和养分是实现细胞代谢和 功能的关键。血管内皮细胞作为血管结构的重要组成部分之一，具有调节细胞 活性分子表达、血管新生以及血管渗透性的功能。因此，仿生构建具有调节血 管内皮细胞粘附、增殖、生存的细胞外基质（ECM），是解决人工构建功能性 组织或器官时缺乏充足血管系统问题的方法之一。 本文利用基因重组技术，分别构建了含有血管内皮细胞生长因子（VEGF）、 免疫球蛋白 IgG 的 Fc 段基因序列的重组质粒 pcDNA3.1-VEGF-Fc 和含有 VEGF 、 MMP-2 特 异 内 切 底 物 和 Fc 段 基因 序 列 的 重 组 质 粒 pcDNA3.1-VEGF-SMP-Fc。用人胚胎肾 293 F 细胞真核体系表达融合蛋白 VEGF-Fc 和蛋白酶敏感型融合蛋白 VEGF-SMP-Fc，且经蛋白质 A 亲和层析色 谱柱纯化后，两种融合蛋白纯度均达到 85 %以上。再分别将纯化的融合蛋白物 理吸附固定在疏水聚苯乙烯材料表面，形成生长因子型人工 ECM 和蛋白酶敏 感型人工 ECM。 结果表明，融合蛋白 VEGF-Fc 构建的人工 ECM 显著性提高人脐带血管内 皮细胞（HUVECs）在疏水材料表面的粘附能力，并且在 72 h 内有效促进 HUVECs 增殖。通过细胞骨架染色，可以明显看出在融合蛋白 VEGF-Fc 基质表 面生长的内皮细胞诱导肌动蛋白纤维重新组合形成应力纤维。且生长因子型人 工 ECM 能有效调节内皮细胞功能性分子的表达，在基质表面快速形成内皮层， 进而调节血管的形成和渗透性。 此外，与商品化 VEGF-165 的半衰期（约 12 h）相比，融合蛋白形式存在 的 VEGF (VEGF-Fc 和 VEGF-SMP-Fc)的半衰期提高到 96 h。MMP-2 敏感型融 合蛋白 VEGF-SMP-Fc 通过其 Fc 段和聚苯乙烯表面的疏水作用，稳定的固定在 疏水聚苯乙烯表面，形成蛋白酶敏感型人工 ECM。通过 MMP-2 含量的变化可 以实现 VEGF 控制释放。 关键词：组织工程；细胞外基质；血管再生；基因重组；血管内皮细胞生长 因子；细胞外基质蛋白酶；胶原；控制释放 ABSTRACT The large network of blood vessels in vivo provides the efficient oxygen and nutrients for cells growth, which plays a key role on cell metabolism and function. Vascular endothelial cells, the important part of vascular, regulate angiogenesis and vascular permeability and the expression of cell activity molecules. Therefore, the construction of biomimic extracellular matrix (ECM) with the functions of vascular endothelial cell adhesion, proliferation and survival regulation is an important solution for artificial functional tissue or organ lacking of adequate vascular system. In this study, owing to the development of recombinant DNA technology, the plasmid of pcDNA3.1-VEGF-Fc containing the vascular endothelial growth factor (VEGF) and immunoglobulin IgG Fc fragment coding sequence and the plasmid of pcDNA3.1-VEGF-SMP-Fc containing VEGF, MMP-2 specific substrate and the Fc fragment coding sequence were constructed, respectively. Then, the fusion protein VEGF-Fc and VEGF-SMP-Fc were expressed by the eukaryocyte expression system and pu