互隔交链孢酚对nih3t3细胞中dna聚合酶β基因的致突变作用-生理学专业论文.docxVIP

2005年郑州大学硕士论文 2005年郑州大学硕士论文 互隔交链孢酚对NIH3T3细胞中DNA聚合酶B基因的致突变作用 互隔交链孢酚对NIH3T3细胞中 DNA聚合酶B基因的致突变作用 硕士学位申请人 朱涵 推荐导师 董子明章茜 郑州大学基础医学院 郑州450052 摘要 目的互隔交链孢霉是从食管癌高发区林县粮食中分离出的一株污染菌，而 互隔交链孢酚(alternariol，AOH)是从中分离的一种毒素，可能引发细胞癌变， 以往的研究表明它与食管癌的发病有一定关系。 DNA聚合酶B(DNA polymerase B，pol B)是人体内主要的碱基切除修复聚合 酶。近年来发现，它在组织的异常表达与人类肿瘤发生有一定的关系，尤其是 在食管癌组织内发现存在有po]B基因的突变，且突变形式与其他肿瘤有很多不 同之处，因而，它的生物学功能越来越受到人们的关注并成为研究食管癌的发病 机理的新视点。 本研究的目的在于观察互隔交链孢酚对NIH3T3细胞中DNA聚合酶B基因突 变的影响，探讨互隔交链孢酚致癌可能的机制，并为进一步研究pol$的生物学 功能和特性研究提供实验依据。 材料方法将本研究室冻存的NIH3T3细胞复苏后培养，待其生长情况良好， 用含有不同浓度的互隔交链孢酚(AoH)的培养液作用于NIH3T3细胞，分为五组： ①正常细胞组；厘)AOH浓度为2 u mol／L组；③AOH浓度为4 u mol／L组；@AOH 浓度为8umol／L组；⑤AoH浓度为16umol／L组。首先提取细胞的总RNA，用 RT—PCR方法从细胞总RNA中扩增出DNA聚合酶0基因eDNA序列，应用T—A克隆 技术，克隆至pGEM-T easy载体后，选用JMl09菌株，用氯化钙法制备感受态细 菌，将目的基因转入宿主细菌内，蓝白筛选、通用引物扩增鉴定后，送上海生物 工程公司进行测序，用DNASIS、OMIGA软件分析序列变化，与GenBank中DNA 2005年郑州大学硕士论文 2005年郑州大学硕士论文 互隔交链孢酚对NIH3T3细胞中DNA聚台酶B基因的致突变作用 聚合酶B基因序列进行比较，分析蛋白质结构及其变化。同时从细胞总RNA中扩 增出B—actin基因，将DNA聚合酶B的表达情况与B—actin表达情况进行比较， 用半定量分析了解DNA聚合酶B表达量的变化。 结果正常细胞组和2“mol／L AOH处理组的DNA聚合酶B基因序列无任何 变化，而4H mol／L，8u mol／L和16u mol／L AOH处理组中都出现了115位点的 T—C突变(导致39位氨基酸Tyr—HiS)；此外，4umol／L AOH处理组中发生了 532位点T—C突变(导致177位氨基酸cys—Arg)，8p mol／L AOH处理组中发 生了206位点T—c突变(导致69位氨基酸Ile--Thr)，16u mol／L AOH处理组 中发生了351位点A—T突变(导致117位氨基酸Glu--Asp)。同时，通过半定 量分析与B—actin表达量的对比发现，DNA聚合酶B表达量随着AOH浓度的增高 而增高。 结论AOH可导致NIH3T3细胞中的DNA聚合酶B发生点突变，AOH的作用浓 度升高，DNA聚合酶B的表达量会增多，推测AOH的致癌作用可能与引发细胞中 DNA聚合酶B基因突变和高表达有关。 关键词互隔交链孢酚；DNA聚合酶B； NIH3T3细胞； 突变 2 2005年郑州大学硕士论文 2005年郑州大学硕士论文 互隔交链孢酚对NR-13T3细胞中DNA聚合酶日基因的致突变作用 Mutagenesis of aiternariol Oil DNA polymerase beta in NIH3T3 cell line Master’s degree proposer Zhu Han Tutors ofrecommendation Dang ZJming Zhang Qian Medicine College of Zhengzhou Universny Zhengzhou 450052 Abstract Objective Alternariol(AOH)is a toxin of mildew isolated from the corn in Lin county,where is the region with a high risk of esophageal carcinoma．Recent evidences showed thatAOH may involved in esophageal carcmoma． DNA polymerasel3(po