蛋白质组学方法筛选肺癌相关蛋白及人源性肺癌单链抗体库的构建病理与病理生理学专业论文.docxVIP

郑州大学博士学位论文 郑州大学博士学位论文 蛋白质组学方法筛选肺癌相关蛋白及人源性肺癌单链抗体库的构建 蛋白质组学方法筛选肺癌相关蛋白及 人源性肺癌单链抗体库的构建 博士研究生 张慧珍 导 师 吴逸明 教授 中文摘要 肺癌是严重危害人类健康的恶性肿瘤之一，也是目前全世界发病率和死亡率 最高的癌症。肺癌的发生、增殖、侵袭是多因素参与、多步骤完成的，虽然从基 因水平和转录水平已对肺癌进行了许多成功的研究，但其癌变机制仍不十分明 确，也缺乏有效的用于肺癌预警和预后监测的特异分子标志物。因而能够高效率、 高通量地筛查组织中与肺癌发生、发展相关蛋白并制各其抗体，在肺癌肿瘤的预 警、筛检、预后、治疗中显得极为重要。 本课题应用蛋自质组学技术对肺癌组织与配对的癌旁组织的蛋白质组进行 筛选和识别，根据蛋自质表达差异筛选肺癌相关蛋白；运用蛋白质纯化技术从肺 癌组织中获得HSP70纯品，并从噬菌体表面展示技术构建的人源性肺癌单链抗 体库中初步筛选到融合抗体。对我国高发肿瘤的防治实践有重要的应用价值，对 阐明肺癌发生的分子机制和预后研究以及靶向治疗有重要理论意义。 研究方法： 1蛋自质组学方法筛选鉴定肺癌相关蛋白 1．1收集16例手术切除的新鲜肺癌组织及同一患者手术的癌旁组织，标本均于液 氮中保存备用。用双向电泳蛋白裂解液提取可溶性总蛋白，并用Bradford方法测 定蛋白浓度。用于分析型和制备型凝胶上样量的依据。 1．2应用等电聚焦(ⅢF)电泳和十二烷基磺酸钠聚丙烯酰凝胶电泳(SDS—PAGE) 技术将16例配对的肺癌组织和癌旁组织可溶性总蛋白分离，得到肺癌的蛋白质 郑州大学博士学位论文 郑州大学博士学位论文 蛋白质纽学方法筛选肺癌相关蛋白及人源性肺癌单链抗体库的构建 组分析型双向电泳图谱，用GS一800图像扫描仪获得凝胶图像，经PDQuest凝胶 图像分析软件进行图像调整、点检测、点匹配、数据分析后，找出差异蛋白点。 l_3将差异蛋白点的特异蛋白从制各型凝胶上挖下，胶内酶解后，经基质辅助电 离解析飞行时问质谱(MALDI—TOF-MS)获得肽质量指纹图谱(PMF)，搜寻蛋白 质数据库并联合生物信息学，鉴定蛋白质，分析蛋白的生物学意义和生物学功能， 作为肺癌标志物的候选蛋白。 2人源性肺癌单链抗体库的构建 2．1反转录PCR(RT-PCR)扩增肺癌患者转移淋巴结中抗体轻链可变区基因VL 和重链可变区基因VH，酶切PCR产物，用磷酸化的Linker将两者连接，再与 噬菌粒DCANTAB 5E进行双酶切连接，电击转化处于感受态的大肠杆菌TGl，经 氨苄青霉素抗性筛选后，形成噬菌体表面展示的单链抗体库。 2．2制备抗体库上清液，PEG沉淀浓缩，检查上清噬菌体抗体滴度，同时扩增辅 I坊噬菌体KMl3。 3肺癌相关蛋白热休克蛋白70(HSP70)的纯化、鉴定 3．1肺癌组织加入裂解液经过匀浆、超声破碎以及100，0009超速离心后，得到 的上清为肺癌组织蛋白。将ConA凝胶填料装柱，制成lml柱体积的ConA亲和 层析柱，首先平衡亲和柱，将提取好的蛋白质过柱，进行亲和层析，收集不结合 蛋白部分。 3．2将收集到的蛋白成分置于渗透液中，过夜透析后在快速蛋白液相色谱系统中 进行DEAE离子交换层析。平衡DEAE预装柱，上样透析过的蛋白，进行梯度 洗脱，接收组分，冻干。 3．3用SDS—PAGE电泳确认得到的蛋白组分分子量，分子量在70KD附近的应该 确认为HSP70，并标记组分蜂，作为下次纯化的依据。再用Western blot方法， 鉴定其免疫原性。以纯化的HSP70为抗原对抗体库进行4轮吸附一洗脱一扩增 的筛选得到含有融合抗体的富集抗体库。 结果与分析： l蛋自质组学方法筛选鉴定肺癌相关蛋白 1．1分别将16例肺癌配对组织提取物，经过重复3次双相电泳，经银染，通过 GS．800扫描得到的蛋白图谱极其相似，建立了肺癌组织蛋白质表达谱。 1．2经PDQuest凝胶图像分析软件进行图像调整、点检测、点匹配、数据分析后， Ⅱ 郑州大学博士学位论文 郑州大学博士学位论文 蛋白赝组学方法筛选肺癌相关蛋白及人源性肺癌单链抗体库的构建 肺癌组织蛋白质2DE图谱显示有685个斑点，癌旁有662个斑点，其中两个罔 谱匹配的蛋白质斑点为523个。17个蛋白质斑点只在肭癌组织检测到有表达， 而在癌旁组织未检测到：6个蛋白质斑点只在癌旁检测到表达。另外，有4个点 在癌组织中表达高于癌旁组织5倍以上，9个点在癌旁组织中的表达高于癌组织 5倍以上。 1．3对高丰度的肺癌特异表达的蛋白点进行鉴定与分析，表明这些特异蛋白点分 别为钙粒蛋白B(Calgranulin B)和Calgizzarin、载脂蛋白A-I(ApolipoproteinA·1 precursor)和载脂蛋白E(