大鼠骨髓间充质干细胞体外培养及其分化为神经元样细胞的实验研究神经病学专业论文.docxVIP

大鼠骨髓间充质干细胞体外培养及其分化为神经元样细胞的实验研究 大鼠骨髓间充质干细胞体外培养及其分化为 神经元样细胞的实验研究 中文摘要 目的 本研究通过建立大鼠BMSCs体外分离、纯化的培养方法，观察G．CSF对 BMSCs增殖的影响，并对G-CSF和GDNF在BMSCs神经细胞分化中作用进行探 讨。 方法 l、无菌条件下采集2周龄SPF级SD大鼠的股骨和胫骨的骨髓细胞，使用含 10％FBS的DMEM／F12培养液进行培养，从细胞贴壁性、免疫表型和脂肪分化三 方面进行BMSCs鉴定： 2、MTT法测定G-CSF对BMSCs增殖的影响； 3、取P5细胞，10ng／ml bFGF进行预诱导24h后，按GDNF和不同浓度的G．CSF 组合分组(B1．5)进行成神经元细胞诱导，并从细胞形态变化、RT-PCR对GFR-o【_l mRNA表达水平进行检测，鉴定诱导所得细胞； 4、统计学数据均用均数士标准差(i±s)表示，采用SPSSl3．0软件处理， 方法是单因素方差分析和g检验法，检验水准仪=o．05。 结果 l、全骨髓差异贴壁法获得的原代细胞开始呈现球形，散在分布，混杂其他 细胞，24h后开始贴壁生长，逐渐伸展呈梭形外观，经换液、传代，BMSCs得 以纯化，进入对数生长期，细胞集落呈辐射状或漩涡状；台盼蓝拒染活细胞计数 法显示，活细胞率达95％以上； 2、SABC法检测显示，细胞阳性表达CDl05(阳性染色率960／0-．97．5％)， 造血祖细胞和内皮细胞标记物CD34和巨噬细胞和单核细胞显著表达的CDl4， 几乎不表达(阳性染色率1％)，说明获得细胞中几乎不包含以上几种常见的混 杂细胞，BMSCs纯度高； 3、在成脂条件培养基诱导下，细胞第3日即有脂肪滴形成，脂滴逐渐增大、 融合，油红O染色后，脂肪被染成橙红色，提示阳性染色；4、MTT测定Go-3第1、3、5、7天的OD值，其中，Go阴性对照组，各时 融合，油红O染色后，脂肪被染成橙红色，提示阳性染色； 4、MTT测定Go-3第1、3、5、7天的OD值，其中，Go阴性对照组，各时 间点的OD值组内差异有统计学意义(闷．05)，OD值呈下降趋势：Gl、G2、 G3实验组，各时间点的OD值组内差异均有统计学意义(尸．o．05)，OD值呈上 升趋势，G-CSF起到促进BMSCs增殖的作用；G2、G3组与Gl比较，同一时间 点组间OD值差异有统计学意义(p，0．05)，G2、G3组OD值较高，细胞增殖力 比Gl强；G2与G3两组，同一时间点组间OD值差异均无统计学意义(Po．05)， G-CSF适宜浓度为10ng／ml，增加浓度并不能进一步提高细胞增殖力； 5、在bFGF预诱导条件下，个别细胞出现胞体回缩。B2．5各组细胞进一步诱 导后，细胞胞质逐渐向细胞核收缩，细胞呈圆形或多角形，部分见突起伸出，甚 至长出分支，类似于树突，神经元形态更加典型，以B4、B5明显，而B1阴性对 照组的细胞形态无明显变化； 6、RT．PCR半定量测定诱导后的细胞GFR-txl mRNA表达水平：各组样本 均可检测到内参[3-atin的清晰条带，诱导组B2~B5均表达GFR-otl，而Bl阴性对 照组始终未见目的基因表达，说明几种诱导方案均可诱导BMSCs分化为表达 GFR-otl的神经元样细胞。分析灰度各诱导组比值发现： B2-5实验组，同一时间点组间灰度比值差异有统计学意义(脚．05)； B3与B2比较，同一时间点组间灰度比值差异无统计学意义(尸o．05)，两组 诱导效率差异不明显，低浓度的G-CSF(5ng／m1)不能发挥其诱导作用； B4、B5与B3比较，同一时间点组间灰度比值差异有统计学意义(po．05)， B4、B5诱导效率更高； B4与B5相比，同一时间点组间灰度比值差异无统计学意义(尸o．05)，两组 诱导效率无明显差异，G．CSF的适宜浓度为lOng／rnl，增加G-CSF浓度并不能提 高目的基因表达量。 结论 1、差速贴壁法可以有效地分离纯化BMSCs； 2、G-CSF可有效地促进BMSCs增殖； 3、联合应用GDNF和适宜浓度的G．CSF，比单用GDNF更有效地诱导BMSCs 分化为表达GFR-ctl的神经元样细胞。 2 关键词骨髓间充质干细胞；分化；粒细胞集落刺激因子 关键词 骨髓间充质干细胞；分化；粒细胞集落刺激因子 3 Study Study on Differentiation of Rat Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells into Neuron．1ike Cells in Vitro Abstract objective To establish a method that separate and pudfy bone mesenchy