改建型stat1基因转染对ifn干预nsclc细胞增殖和表达的影响内科学呼吸病学专业论文.docxVIP

温州医学院硕士学位论文改建型STATl基因转染对IFN干预NSCLC 温州医学院硕士学位论文 改建型STATl基因转染对IFN干预NSCLC 细胞增殖和表达的影响 中文摘要 目的： 信号转导与转录激活因子1(STATl)是STAT家族中最早被发现的转录因子， 参与IFN的信号转导过程，为先天性免疫所必需。IFN．y等细胞因子通过 JAK．STAT途径激活STATl使目的基因表达，从而起到抑制细胞生长和抗细胞增 殖的作用。本研究通过构建携带STATl基因和突变型STATl．CC基因的慢病毒表 达载体，转染肺癌A549细胞和H1299细胞并检测S”汀l和SL订1．CC基因在肺癌 A549细胞和H1299细胞内的表达。STATl基因和突变型STATl．CC基因转染非小 细胞肺癌细胞株，观察STATl基因和突变型STATl．CC基因对IFN干预NSCLC细胞 增殖和表达的影响。 方法： 1、采用PCR技术从质粒模板中扩增得到目的基因STATl和STATl．CC，将其 接入与含有CMV启动子和绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Proteim EGFP)的慢病毒载体中，构建慢病毒载体表达载体Lenti．STATl和 Lenti．STATl．CC，双酶切和测序鉴定。分别将重组子Lenti．STATl，Lenti．STATl．CC 和包装质粒共转染293T细胞，包装产生慢病毒颗粒，感染非小细胞肺癌细胞株 A549和H1299。荧光显微镜观察A549细胞和H1299细胞EGFP表达，Western Blotting验h正STATl在A549细胞株并1]H1299细胞中的表达。 2、转染后的H1299细胞可以分为四组：H1299组(即空白组)，SL7组(即 EGFP空载体对照组)，STATl组，STATl一CC组。MTT法测定各组H1299细胞的生 长曲线。用不同浓度的IFN．Y(浓度分为：0．05ug／ml，0．25 ug／ml，0．5 ug／ml，l ug／m1)处理四组细胞，72h后处理组和未处理组分别采用MTT法检测各组的吸光 度值，得出各组细胞的生长抑制率。选取浓度为0．25 ug／ml的IFN-y处理四组细 胞经0．5h，12h，24h，72h后，采用Western Blotting方法检测各组细胞的STATl磷 酸化P．STATl蛋白的表达情况。 3、本论文为该实验的前期研究，由于时间的关系，仅完成其中部分实验内 容，尚未完成IFN干预NSCLC细胞后引起JAK-STATl通路的下游因子变化的检 测，需要后期进一步研究。 结果： 温州医学院硕士学位论文1、酶切及测序结果显示成功构建重组慢病毒表达载体Lenti．STATl和 温州医学院硕士学位论文 1、酶切及测序结果显示成功构建重组慢病毒表达载体Lenti．STATl和 Lenti．STATl．CC，将慢病毒颗粒感染A549细胞48h后，观察到宿主细胞内绿色 荧光蛋白表达，Western Blotting证实STATl蛋白在A549细胞和H1299细胞中 过表达。 2、稳定转染后的H1299细胞：H1299组(即空白组)，SL7组(即EGFP 空载体对照组)，STATl组，STATl．CC组，STATl具有抑制肺癌H1299细胞生 长的作用，STATl．CC基因可以提高STATl对肺癌H1299细胞生长抑制作用。 3、稳定转染后的四组H1299细胞经不同浓度的IFN．Y(浓度分为t 0．05ug／ml， 0．25 ug／ml，O．5 ug／ml，1 ug／m1)处理72h后，在同一浓度STATl．CC组细胞的 生长抑制率显著高于其他三组(P0．01)，并且这种抑制不存在浓度依赖性。 4、浓度为0．25 ug／ml的IFN．Y处理四组H1299细胞采用Westem Blotting 方法检测处理组和未处理的四组细胞的STATl磷酸化P．STATl蛋白的表达情 况。IFN-y处理时间在0．5h，12h，24h，72h时，可见到在各个时间点STATl．CC 组比其他三组P．STATl蛋白的表达显著增高(P0．01)。 结论： 1、本实验成功构建了携带STATl基因和STATl．CC基因的慢病毒表达载体， 在A549细胞和H1299细胞中过表达STATl基因。 2、STATl具有抑制肺癌H1299细胞生长的作用，STATl．CC基因可以提高 STATl对肺癌H1299细胞生长抑制作用。 3、STATl一CC基因可以增强IFN．Y对肺癌H1299细胞生长的抑制作用。 4、STATl．CC基因可以使IFN．Y刺激的H1299细胞中的P．STATl蛋白表达增 加，有望使IFN联合改建型STATl．CC成为肺癌基因治疗的新方法。 关键词：STATl；IF