大豆种子特异性启动子的克隆与功能研究微生物学专业论文.docxVIP

南开大学博士研究生毕业(学位)论文 南开大学博士研究生毕业(学位)论文 中文摘要 中文摘要 随着分子生物学理论和基因工程技术的不断发展，植物转基因技术已成为一种 新型农业技术，全球性生物农业的大发展是大势所趋。但是，目前的植物基因工程 技术也有不少不足之处，如表达量低、遗传不稳定和基因沉默等，为了克服这些缺 点，进行了多方面的探索和研究，提出了多种改进和完善植物基因工程技术的方法 和策略。这些方法和策略中，种子特异性启动子的研究和应用是改进植物基因工程 技术的一项重要环节。所谓的种子特异性启动子是指只有在种子成熟的冲、后期启 动下游基因，在种子组织中特异性地、大量转录和表达其下游基因的启动子。种子 特异性启动子～般来自种子或胚乳中富含的贮藏蛋白基因的启动子。 大豆B一伴球蛋白是大豆种子贮藏蛋白的重要组成部分。大豆B一伴球蛋白由 Ct一、n，_和B一亚基等三个亚基组成。本研究通过PCR方法从大豆品种～吉林43 基因组DNA中分离到大豆D一伴球蛋白Q一亚基基因启动子片段(BCSP501)，并对 此片段进行TAILPCR延伸，获得了启动子片段BCSP666。序列分析表明，启动子 片段BCSP666中含有种子特异性启动子所需的启动子序列元件：TATA盒、CAAT 盒外、A厂r富含序列元件、RY重复序列元件、AGCCCA序列元件、TACACAT序 列元件、ACGT序列元件、E盒等多种多拷贝的序列元件。据此推测该启动子片段 具有种子特异性启动子活性。以该片段构建种子特异性表达GUS基因的植物载体 pBll21．666，以花蕾转化方法转化拟南芥，转基因拟南芥中的GUS酶荧光光度分 析和组织化学检测均表明，GUS基因在启动子片段BCSP666调控下获得了种子特 异性表达。再以BCSP666为基础，通过TAIL PCR方法再次延伸而获得启动子片 段BCSP952，并与其它12种种子特异性启动子序列进行了序列对比分析，进一步 证实了BCSP952的种子特异性启动子序列结构特点。这是首次对大豆13一伴球蛋白 n．亚基基因启动子进行序列结构分析和种子特异性功能鉴定。 同时，通过PCR技术从大豆品种～吉林43基因组DNA中分离到大豆0一伴球 蛋白d 7．亚基基因启动子片段(BCSP408)。序列分析表明，这一启动子片段与已报 道的a’一亚基基因启动子相应序列之间的序列同源性达到98％。并用这一启动子和 深黄被孢霉△6．脂肪酸脱氢酶基因(MI D6D)构建了种子特异性表达Y一亚麻酸的 植物表达载纬pBMl408。通过农杆菌介导法将这一植物表达载体pBMl408转化到 大豆子叶节，经过诱导和筛选培养，获得了卡那霉素抗性转基因大豆植株。 关键词：B一伴球蛋白，大豆种子特异性启动子，序列元件，拟南芥，GUS，Y·亚 麻酸 壹茎查兰堕主型壅生生些!堂垡!丝苎 壹茎查兰堕主型壅生生些!堂垡!丝苎 一一生奎!!蔓 ABSTRACT A1though plant gene engineering has been developing rapldly 1n recent years。there are a lot of probleros such as low expresslon level，unstableness and gene si lence．To resolve these problems，many strategies have been developed ineluding the cloning and application of seed—speeific promoters which iS an important method useful to improve the plant gene englneerlng· The so—called seed—specific promoters，which are always obtained from the S-upstream regulatory sequences of seed—storage proteln genes， ODlY express their downstream genes from mid to late stage of seed maturation· And there iS no or much lower expression in other tlssues except seeds- 0一Conglycinin，which is a kind of storage proteins in soybean seeds， iS usuallY synthesized and aeoumulated exclusirely in seed