tlr4在lps激活内皮细胞中的作用及其可溶性受体表达外科学野战外专业论文.docxVIP

TLR4在LPS激活内皮细胞中的作用及其 TLR4在LPS激活内皮细胞中的作用及其 可溶性受体表达+ 摘 要 f脓毒症是严重创伤、烧伤、休克、外科大手术后等常见的并发症，进 一发发展可导致脓毒性休克、多器官功能障碍综合征，已成为临床危重患 者的重要死亡原因。越来越多的研究表明，内皮细胞在LPS引起的内毒 素休克、多器官功能衰竭等病理过程中起着关键的作用。因此，深入研究 LPS激活内皮细胞机制具有非常重要的意义。与巨噬细胞等髓样细胞不 同，内皮细胞不表达mCDl4，LPS对其的激活需要LBP和sCDl4的参与， 加之CDl4缺乏跨膜区和胞浆内段，不能直接和细胞内进行信号交流，强 烈提示内皮细胞膜上存在跨膜信号分子或跨膜受体。发现并鉴定内皮细胞 上的跨膜信号分子，是深入理解LPS激活／损伤内皮细胞机制的关键。新 近发现并广为研究的TLR4给上述研究带来了新的机遇。研究表明：TLR4 是LPS的受体或信号转导分子，在LPS的病理生理效应中具有重要作用。 那么，人内皮细胞是否表达TLR47如果表达，它是否在LPS激活内皮细 胞和信号转导通路中的具有重要作用?TLR4是不是人们长期探索的内皮 细胞上LPS的Rt?如果它在LPS激活内皮细胞和信号转导通路中具有重 要作用，则可以此为靶，探讨可溶性受体的拮抗效应。对此问题的研究， 国内外很少报道。目前研究手段主要采用基因转染、基因突变以及基因敲 除等技术，存在表达量低、技术难度较高、不易掌握的缺点。有报道运用 抗体的手段进行研究，但多为多克隆，存在着针对性不强等问题。所以单 克隆抗体的制备就成为急待解决的问题。 。本课题受国家973项目(G1999054203)、国家自然科学基i和全军医药卫生科研基金 (OlQl05)资助 ?／√ ? ／√ ＼／ 因此y本研究在制作抗人TLR4单克隆抗体的基础上，观察了人内皮 细胞TLR4的表达及LPS对其表达的影响，并对TLR4在LPS激活内皮细 胞和信号转导通路中的作用进行了初步研究：最后，克隆了TLR4的胞外 区，利用毕赤酵母表达系统对其初步表达。旨在为TLR4的相关研究提供 充足的研究材料，初步阐明TLR4在LPS激活／损伤内皮细胞机制和信号 转导通路中的作用。为深入研究和阐明LPS作用机理奠定基础和最终在 细胞受体水平为阻断LPS对内皮细胞的激活／损伤和G’菌脓毒症、脓毒性 休克的防治提供新靶点和新途径。 ／主要结果及结论如下： o、预测的B细胞优势表位为TLR4(189．202)：NH2．HKL TLR NNF DSL NV—COOH，经毛细管电泳分析合成多肽的纯度达98．2％。该表位多 肽能诱发小鼠产生抗TLR4抗血清，其效价为1：32至1：128，该多抗能 特异识别TLR4阳性细胞。表明以此制作抗人TLR4单克隆抗体是可行的。 二、经细胞融合和ELISA筛选，建立了能稳定分泌TLR4单抗的杂 交瘤细胞B4。制备了B4的培养上清和腹水，间接ELISA测定抗体效价， 培养上清为1：64～1：256，腹水的效价为1：10 000。B4分泌的抗体为IgG2， K型，可特异识别TLR4阳性细胞，并具有阻断活性。表明成功制备了抗 人TLR4单克隆抗体。 三、RT．PCR和Western blot检测结果显示，人内皮细胞能表达 TLR4mRNA和TLR4蛋白，LPS能明显上调其表达水平，并呈时间和剂 量依赖性。初步说明TLR4在LPS激活内皮细胞效应中具有重要作用。 四、转染TLR4的功能突变体和运用抗人TLR4单克隆抗体后，LPS 对内皮细胞激活效应明显减弱，表现为NF．K B活性明显降低，呈剂量依 赖性。进一步提示，TLR4在LPS对内皮细胞激活效应中具有重要的地位， 很可能为内皮细胞上LPS作用的受体／信号转导分子。 五、TLR4介导LPS对内皮细胞激活具有cDl4依赖性，同时，sCDl4 可明显上调LPS对转染TLR4的293细胞NF．K B激活，初步说明TLR4 与CDl4间可能存在相互作用。成功构建了TLR4胞外区和CDl4的酵母 表达载体，转化酵母Y187后，发现它们本身无自发激活活性，对酵母细 表达载体，转化酵母Y187后，发现它们本身无自发激活活性，对酵母细 胞也无毒性。酵母双杂交体系的实验结果表明，TLR4与CDl4间存在相 互作用。初步提示这可能为LPS跨膜信号转导的一种模式，为深入研究 LPS的跨膜信号转导机理奠定了基础。 六、成功构建了pPIC9K．TLR4酵母表达载体，经酶切和测序鉴定完 全正确。电转化GSll5酵母菌后，经MD／一His和G418筛选，共获得了 200多个高拷贝菌株，并对其中的几个克隆进行PCR鉴定。结果表明， TLR4的胞外区基因完全整合到酵母菌中。 七、运用毕赤酵母初步表达了可溶