富血小板血浆对骨髓间充质干细胞体外成骨的影响外科学专业论文.docxVIP

硕士学位论文 硕士学位论文 中文摘要 富血小板血浆对骨髓间充质干细胞体外成骨的影响 中文摘要 目的：探讨在体外培养中富血小板血浆(PRP)对犬骨髓间充质干 细胞(BMSCs)诱导成骨的影响，为骨组织工程提供依据。 方法：(1)抽取比格犬骨髓，密度梯度离心法分离获取骨髓间充 质干细胞；进行原代培养；按1：3传代培养。倒置显微镜观察细胞形 态。MTT法测定3、5、10代细胞生长曲线。(2)抽取比格犬后肢静脉 血10ml，两步离心法制备富血小板血浆，人工计数血小板，将富血小 板血浆按1：1的比例与含100u／ml牛凝血酶的10％氯化钙溶液激活剂混 合反应形成富血小板血浆凝胶。(3)将第3代比格犬骨髓间充质干细胞 分为四组，分别加入含胎牛血清体积分数为10％的低糖DMEM为I组； 含胎牛血清体积分数为10％、地塞米松10一mol／L、B一甘油磷酸钠 10mmol／L、维生素C 50mg／L的高糖DMEM为II组；含富血小板血浆凝 胶6．25％的低糖DMEM为Ⅲ组；含富血小板血浆凝胶6．25％、地塞米松 10—8m01／L、B一甘油磷酸钠lOmmol／L、维生素C 50mg／L的高糖DMEM 为Ⅳ组。(5)倒置显微镜观察各组细胞形态变化；碱性磷酸酶检测试 剂盒检测各组细胞内碱性磷酸酶含量；改进Von Kossa染色标记钙结 节形成情况；免疫细胞化学染色检测各组I型胶原的表达；RT—PCR检 测各组骨钙素mRNA的表达。 结果：(1)原代培养后有初起克隆集落形成，并可见细胞分裂相； 3d后可见梭形类成纤维细胞明显增多，8～10d单层细胞融合接近90％， 硕士学位论文 硕士学位论文 中文摘要 呈漩涡样生长。1：3传代的细胞2d左右即可见细胞贴壁，一般lOd左 右完成贴壁，传3代以后细胞形态均一，呈长梭形，接近融合状态时 可呈漩涡样生长。(2)生长曲线显示传3、5代骨髓间充质干细胞均有 较强的增殖能力，其中传3代细胞更为明显，而传10代细胞的增殖能 力有所减弱。 (3)人工血小板计数结果为静脉血中血小板为143．5 士33．1×109／L， 富血小板血浆为1239±174．07×109／L。 (4)倒置显 微镜观察Ⅱ、Ⅳ组细胞由梭型渐变为三角形、多角形、圆形，有自发 聚集倾向，与I、Ⅲ组有明显区别。Ⅲ组细胞增殖较I组更快。(5) 各组碱性磷酸酶含量均随时间的延长而逐渐增高，各组比较而言，Ⅳ 组活性最高。(6)成骨诱导14d，改进Von Kossa染色可见II、Ⅳ组可 见钙结节产生。(7)成骨诱导14d后，I型胶原免疫细胞化学染色显示 Ⅱ、Ⅳ组呈阳性。(8)诱导后7，14d后RT—PCR鉴定各组骨钙素mRNA的 表达，各组均分别在185bp有单一的目的条带，诱导后7，14d时间点 Ⅱ、Ⅳ组组骨钙素mRNA的表达水平均强于I、Ⅲ组；I与Ⅲ组之间无 显著性差异，而Ⅳ组各表达水平均强于II组。 结论： (1)犬骨髓间充质干细胞有较强的生长增殖能力，能在体外诱导 剂的作用下诱导成骨。 (2)富血小板血浆能在体外显著促进诱导骨髓间充质于细胞成骨 效果，并能够稳定表达成骨特异性表型。 Ⅱ 硕士学位论文 硕士学位论文 中文摘要 关键词 富血小板血浆骨髓间充质干细胞诱导成骨I型胶原 骨钙素 ⅡI 硕士学位论文 硕士学位论文 英文摘要 Influence of platelet—rich plasma on osteogenetic activity of marrow mesenchymal stem cells in vitro ABSTRACT Objective：To investigate the influence of bone marrow mesenchymal stem cells in osteoblastic reaction and the induction of 。differentiation cultured with PRP in vitro；To provide theories foundation for bone tissue engineering． Methods：(1)Beagle’S BMSCs are isolated from bone