杜氏盐藻核基质结合区的分离及其对转基因的表达调控作用病理学与病理生理学专业论文.docxVIP

杜氏盐藻榱基质结合区的分离及其对转基因的表达调控作用 杜氏盐藻榱基质结合区的分离及其对 转基因的表达调控作用 博士研究生 王天云 导 师 薛乐勋 郑州大学细胞生物研究室， 郑州450052 中文摘要 核基质结合区(matrix attachment regions，MARs)又叫核骨架附着区(scaffold attachment regions，SARs)是染色质被限制酶消化后仍与核基质或核骨架结合的 DNA序列。MAR长度由300bp至2，000bp不等，通常富含AT碱基对，常含有 一些特征性基序(motifs)，如A-box(AATAAAAMCAA)、T-box伽A1Wrrn、 酵母自主复制序列(autonomously repficadng DNA sequence，ARS)、果蝇拓朴异 构酶II(Topoisomerase II)识别位点和能形成蛋白质识别位点的松散 DNA(unwinding DNA)、弯曲DNA(curved DNA)等。MARs与核基质结合受AT 区的位置及结构影响，其二级结构表现为狭窄的DNA小沟，易于弯曲和解链。 MAR一般位于功能转录单位的侧翼，作为一种边界元件(boundary elements)，但 也有一些MAR位于某些基因的内含子中。虽然MAR具有一些序列特征，但比 较不同MAR的碱基序列，发现MAR在碱基组成上并不具保守性。近年来研究 发现，将MAR构建表达载体能提商外源基因的表达水平，增强外源基因表达的 稳定性，克服外源基因沉驮等。MAR还能使染色质形成环状结构，还可以作为 DNA复制的起始点或调控基因的转录。但关于MAR的研究尚处于早期阶段， 其分子调控机制目前仍不清楚。 迄今已有一些MAR从酵母、动物、植物及人类中分离出来，并进行了其功 能的相关研究，但目前所分离的MAR绝大多数来源于高等动植物，单细胞的真 核生物研究的较少，真核藻类的MAR研究未见相关报道。高等动植物存在器官 组织分化问题，不同的分化组织细胞基因表达的方式及其种类不同，MAR序列 也可能存在差别。因此以单细胞的真核生物研究MAR的调控机制更具有特点及 优势。杜氏盐藻(Dunaliella salina)是一种无细胞壁的单细胞绿藻，含有一个大 的杯状叶绿体进行光合作用，具鞭毛，能游动，可在0．05～5M NaCl培养液中 生长，抗逆性极佳，是一种较为理想的抗逆境生存的生物。杜氏盐藻作为生物反 生长，抗逆性极佳，是一种较为理想的抗逆境生存的生物。杜氏盐藻作为生物反 应器生产药物蛋白具有其他植物反应器所不具备的许多独特的优点。本研究的目 的旨在从单细胞的的真核生物—杜氏盐藻中分离MAR并进行其在转基因中的功 能研究，理论上为探讨MAR的功能及其调控机制提供实验基础，实践上为建立 稳定高效表达外源药用蛋白基因的杜氏盐藻生物反应器做些探讨。 本研究中，我们以杜氏盐藻为材料进行了MAR的分离与功能性研究。首先 用二碘水杨酸锂盐(D／iodosai／cyl／c acid litb／um salt,Us)抽提杜氏盐藻细胞核制 各了盐藻核基质，限制酶充分消化，SDs．蛋白酶K提取杜氏盐藻核基质结合区 DNA，连接至pUCl8载体上构建了杜氏盐藻随机MAR文库，蓝白斑筛选出56 个阳性菌落。体外结合实验筛选从构建的杜氏盐藻随机MAR文库中筛选出3个 能与核基质结合的DNA片段，其中2个片段结合能力较强。测序分析3个DNA 片段具有典型的MAR特征，富含AT，具备A-box，T-box等一些典型的特征。 将分离的MAR片段作为调控元件构建到包含氯霉素乙酰转移酶报告基因 (chlommphcnicol acetylUansfera辩，CAT)表达载体pRNC表达盒的两侧，与含 bar基因的表达载体pSP-B1电击共转化杜氏盐藻细胞，草丁瞵(phosphinothricin, PPT)进行抗性筛选，获得了稳定转化的杜氏盐藻藻株。采用EuSA方法检测报 告基因CAT酶活性，结果证实分离的3个MAR片段能分别提高报告基因CAT 酶活性1．5倍，4．5倍及2．2倍。Southern blotting证实转化的CAT基因已经整 合到转化的杜氏盐藻基因组DNA上。Northern blotting分析证实CAT报告基因 能在RNA水平进行转录与表达。 第一部分杜氏盐藻核基质结合区的分离及特征性分析 1方法： 1．1杜氏盐藻细胞核的制各 采用0．5％TritonX-100裂解对数期的杜氏盐藻细胞，15％Peacoil分离纯化， 分离盐藻细胞核。 1．2核基质的制备及核基质强白的鉴定 采用25 mM LIS抽提分离的杜氏盐藻细胞核，制各杜氏盐藻细胞核基质。采 Ⅱ 用10％分离胶、30％聚丙烯酰胺SDS鉴定分离的盐藻细胞核基质蛋白。