杜氏盐藻异养转化藻株的鉴定及初步功能分析细胞生物学专业论文.docxVIP

琢创性声明本人．；ll【霆声明：所望交的学位论文，是本入在导师的指蟹下。独立送行研 琢创性声明 本人．；ll【霆声明：所望交的学位论文，是本入在导师的指蟹下。独立送行研 究所取褥的成果。除文中已经注明引用的内容外，本沦文不包禽任何其他个人 或集体已经发袭绒撰写过的科研成果。对本文的研究擞掇霪簧贡献的个人和集 体，均已在文巾以明确方式标明。本声唆的法律责任幽本人承担。 学位论文作者： 晷乏名 日期彩矽年f月归 } 学位论文使用授权声明 本人在导师撬导下完成的论文及横关的职务作晶，知_【f{产权归属郑州大学。 搬据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校缳爨或向国家有关鄢 r J翻：规构送交论文的复印件和电予版，允许论文被套嘲和借阅；本人授权郑州 大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索，可以采用影印， 缩印或者其他链制手段{!；i}存论文和汇编本学位论文。本人岗校螽发表、使阁学 位论文或与该掌位论文直孩榴关的学术论文线成鬃时，第 署名肇使仍然为郑 炽大学。缳密论文在解密厢应遵≮}此规定。 学位论文雠髫交名 翻期：多矽年夕月护 } 摘要摘要 摘要 摘要 杜氏盐藻(Dunaliella salina，D．salina)是一种单细胞的真核绿藻，无细 胞壁，属于光合自养型生物。杜氏盐藻本身有很多优点：可在0．05----5 M NaCl 的极端环境中生存因而赋予其较强的抗污染能力；遗传操作简便；具有翻译后加 工修饰；培养条件简单、成本低、生长周期短；自身营养价值很高；无毒无害等 优点，使得盐藻成为一种表达外源基因的良好宿主。因此，开发盐藻作为生物反 应器生产多种具有生物活性的外源蛋白如药用蛋白、血管抑素、抗体和疫苗等具 有巨大的应用前景。 盐藻的培养有两种方式：一种是开放池式的大规模培养，但是易受微生物污 染、气候、光照、营养条件以及昼夜温差等因素的影响；另外一种是封闭式的光 照生物反应器培养，但是利用光照生物反应器培养存在接种量大和光抑制效应等 缺点。因此使得盐藻的生长速率和生物量难以大幅度提高，从而盐藻的利用受到 了很大的限制。通过基因工程手段改变盐藻的营养模式(从光合自养型向异养型 过渡)从某种程度上可以最大限度提高盐藻的生物量，为从根本上解决上述可能 的难题提供理论依据。 莱茵衣藻、小球藻、硅藻等藻类的异养研究发现，转入单个外源基因如小球 藻的HUPl基因(H+／hexose cotransporter 1)、人红细胞的Glutl基因(Glucose transporterl)以及酿酒酵母的Hxtl、Hxt2和Hxt4基因等转变藻类的营养模式后， 这些藻类可以利用外源的糖类进行异养生长，其生长速率和细胞密度均显著提 高。葡萄糖转运蛋白(Glutl)是葡萄糖转运蛋白家族中的一种通道转运蛋白， 位于细胞膜表面，是葡萄糖转运的主要载体。因此在本研究中我们尝试将Glutl 基因转入盐藻细胞中以改变盐藻的营养模式，从而为提高盐藻的生长速度提供理 论基础，为进一步建立杜氏盐藻生物反应器提供可行性思路。 本课题组前期已经从人胎盘组织中克隆了人Glutl基因，并通过测序证实 所克隆的Glutl基因序列的正确性，进一步利用基因重组技术构建了盐藻组成 型和诱导型异养表达载体。本课题是在此基础上通过优化的电击转化方法将两 种异养表达载体转入杜氏盐藻细胞中，利用草丁膦(Phosphinothricin，PPT)通 过液体和固体筛选出杜氏盐藻异养转化藻株。结果表明，在PPT浓度为6 pg／mL 摘要时对照野生藻全部死亡，而转化藻株生长良好，在此基础上共筛选出了3株组 摘要 时对照野生藻全部死亡，而转化藻株生长良好，在此基础上共筛选出了3株组 成型异养藻株和2株诱导型异养藻株，分别命名为：CI、C2、C3、11和12。 进一步对筛选出的5株异养转化藻株进行RT-PCR鉴定，结果显示，5株转化藻 株在相应大小的位置都出现了约为250 bp的较为特异的DNA条带，提示外源 基因Glutl已成功整合到杜氏盐藻异养转化藻株的基因组中。 在转基因生物体中，转基因拷贝数对目标基因的表达水平和遗传稳定性有 很大地影响，这使得转基因拷贝数的估算成为转基因生物研究中的重要内容和 课题之一。实时荧光定量PCR(Real．time Quantitative PCR)和Southern boring 技术是目前研究转基因拷贝数较为理想的方法，因此我们利用这两种技术分析 5株异养转化藻株的拷贝数，结果发现3株盐藻组成型异养转化藻株C1、C2 和C3的Glutl基因拷贝数分别为：2、l和3；2株杜氏盐藻诱导型异养转化藻 株Il和12的Glutl基因拷贝数分别为：4和4。Southern blotting检测Cl、C2 和C3的拷贝数与Real．time