杭州地区犬细小病毒血清及分子流行病学研究-预防兽医学专业论文.docxVIP

目录目 目录 目 录 摘 要 ．1 Abstract ． ． ． ． ．3 前言 5 第一部分 6 第一章犬细小病毒研究进展 ．7 1．CPV的发现及危害 7 2．CPV的一般生物学特性 ．．7 2．1分类地位与形态 ．7 2．2理化特性 ．．8 2．3血凝特性 8 2．4细胞培养特征 ．．8 2．5流行病学特征 ．9 2．6致病机理 9 3．CPV的分子生物学特征 lO 3．1基因组特征 10 3．2主要蛋白及功能 11 3．3 CPV进入细胞的机制及其在胞内的迁移 12 4．CPV的起源与演化 ．14 4．1 CPV的起源 。14 4．2 CPV的演化 ．．．． ．14 4．3 CPV变异的分子基础 16 5．CPV诊断方法 17 5．1临床症状和病理变化 17 5．2病毒学诊断方法 17 5．2．1电镜观察 ．．17 5．2．2病毒分离与鉴定 ．．】8 5．3免疫学诊断方法 18 5．3．1血凝与血凝抑制(HA．HI)试验 ．．18 5．3．2酶联免疫吸附试验(ELISA) ．1 8 5．3．3胶体金免疫层析法(GICA) 19 5．4分子生物学诊断方法 19 5．4．1 PCR方法 ．19 5．4．2核酸探针技术 20 5．4．2核酸杂交技术 20 6．CPV疫苗研究进展 20 7．小结与展望 ．21 参考文献 ．23 第二部分 ．28 第二章犬细小病毒HZ0761株的分离与鉴定 29 1．材料与方法 ．．29 1．1材料 ．29 目录 目录 1．1．1病料 ．．29 1．1．2细胞及其培养基 ．29 1．1．3主要试剂 30 1．1．4引物 30 1．2方法 ．30 1．2．1病料的PCR检测 30 1．2．2病毒分离 ．3 1 1．2．3病毒鉴定 31 1．2．4病毒纯化 ．34 1．2．5滴度测定 34 1．2．6电镜观察 ．34 1．2．7毒株分型 ．34 2．结果 ．．36 2．1病料的PCR检测 ．36 2．2病毒分离 ．．36 2．3病毒鉴定 37 2．3．1 PCR鉴定 37 2．3．2血凝与血凝抑带O(HA．HI)试验 ．37 2．3．3间接免疫荧光(IFA)实验 ．38 2．3．4病毒纯化和滴度测定 ．．38 2．3．5电镜观察 38 2．4毒株分型 39 2．4．1 PCR扩增VP2基因 ．39 2．4．2序列分析 39 3．讨论 ．．40 参考文献 ．．42 第三章犬细小病毒间接ELISA诊断方法初步建立及血清流行病学调查 ．．44 1．材料与方法 44 1．1材料 ．44 1．1．1菌种、载体及血清 ．44 1．1．2主要试剂 。45 1．2方法 ．45 1．2．1引物设计与合成 45 1．2．2病毒DNA的提取 45 1．2．3 PCR扩增VP2基因 45 1．2．4 PCR产物的克隆 ．45 1．2．5重组质粒在大肠杆菌中的表达 ．．47 1．2．6重组蛋白的纯化 48 1．2．7 Western．blot分析重组蛋白反应原性 ．49 1．2．8间接ELISA方法的建立 ．．50 1．2．9杭州地区犬细小病毒血清流行病学调查 50 2．结 果 ．．51 2．1 PCR扩增CPV VP2基因 。51 2．2重组质粒的鉴定 5】 ．II． 目录2．2．1重组质粒的PCR鉴定 目录 2．2．1重组质粒的PCR鉴定 ．51 2．2．2重组质粒的测序鉴定 51 2．3重组VP2蛋白的可溶性分析 一5 1 2．4重组Ⅵ，2蛋白的纯化 52 2．5 Western．blot分析重组蛋白反应原性 一52 2．6间接ELlSA方法的建立 ．．53 2．7杭州地区犬细小病毒血清流行病学调查 ．53 3．讨论 ．．54 参考文献 ．57 第四章基于VP2基因的杭州地区犬细小病毒分子流行病学研究 ．58 1．材料与方法 ．59 1．1材料 ．59 1．1．1病料与疫苗 ．．59 1．1．2载体和菌种 j 59 1．1。3主要试剂 ．．59 1．2方法 ．．59 1．2．1引物设计与合成 59 1．2．2病料的PCR检测 ．59 1．2．3 PCR扩增阳性病料的VP2基因 ．59 1．2．4 PCR产物的克隆 ．60 1．2．5重组质粒的测序 60 1．2．6 CPV弱毒苗VP2基因的扩增与测序 ．．60 1。2．7序列分析 ．．60 2．结果 60 2．1病料的PCR检测 60 2．2阳性病料VP2基因的扩增和测序 61 2．3 CPV弱毒苗VP2基因的扩增和测序 62 2．4杭州地区CPV VP2基因的遗传进化分析 ～62 2．5 CPV VP2基因的变异分析 ．64 3．讨论 ．72 参考文献 76 结论与建议 78 攻读硕士期间的科研成果 79 致谢 。80 ．．III．． 摘要摘要 摘要 摘