九龙藤总黄酮的提取纯化及抗心肌过氧化损伤作用-心血管内科学专业论文.docxVIP

PAGE PAGE 3 理 …………………….………………………………………………………… ……………………40 2 结 果 …………………………………………….………………………………… ………………………..…….…………41 2.1 心 肌 细 胞 纯 度 鉴 定 …………….……………………………………………………………..…… .………41 2.2 九 龙 藤 总 黄 酮 对 心 肌 细 胞 缺 氧 / 复 氧 损 伤 的 作 用 机 制 .……………...……41 2.2.1 心 肌 细 胞 形 态 学 变 化 ……………………………………………..………….……………………… 41 2.2.2 MTT 法检测心肌细胞活力 42 2.2.3 细胞培养上清液 NOS 活力 43 2.2.4 细胞培养上清液 TNF-α 含量测定 43 2.2.5 Bcl-2、Bax、NF-κβp65 蛋白表达检测 44 2.2.5 流式细胞仪检测心肌细胞凋亡 46 3 讨论 48 4 结论 50 参考文献 51 第三部分 九龙藤黄酮对 H2O2 诱导乳鼠心肌细胞损伤的作用 …… 52 1 材料与方法 53 1.1 实验材料与仪器 53 1.1.1 实验动物 53 1.1.2 主要实验试剂 53 1.1.3 主要实验仪器 53 1.2 实验方法 53 1.2.1 H2O2 诱导乳鼠心肌细胞损伤模型建立及实验分组 53 1.2.2 MTT 法检测细胞活力 53 细胞培养上清液 T-AOC、GSH、T-SOD、MDA、LDH、TNF-α 含量 测定 53 1.2.4 Bcl-2、Bax 蛋白表达检测 53 1.2.5 心肌细胞凋亡率检测 53 1.2.6 统计学处理 54 2 结果 55 2.1 MTT 法检测心肌细胞活力 55 2.2 九龙藤总黄酮对心肌细胞培养上清 LDH、MDA 和 GSH、T-SOD 活性 的影响 55 2.3 细胞培养上清液 T-AOC、TNF-α 含量测定 56 2.4 Bcl-2、Bax 蛋白表达检测 56 2.5 流式细胞仪检测心肌细胞凋亡 58 3 讨论 60 3.1 九 龙 藤 总 黄 酮 对 H2O2 诱 导 乳 鼠 心 肌 细 胞 损 伤 的 抗 氧 化 能 力的影 响 60 3.2 九龙藤黄酮对 H2O2 诱导乳鼠心肌细胞凋亡的保护作用 61 4 结论 63 参考文献 64 综述 66 攻读学位期间发表的学术论文目录 74 致谢 75 1 1 九龙藤总黄酮的分离纯化及抗心肌过氧化损伤作用 中 文 摘 要 目的： 1.考察九龙藤总黄酮的提取纯化工艺 2.研究九龙藤总黄酮对 H2O2 诱发心肌细胞凋亡的作用机制 3.研究九龙藤总黄酮对心肌细胞缺氧/复氧（H/R）损伤的作用 方法： 1. 九龙藤总黄酮的提取纯化工艺考察 1.1 九龙藤总黄酮鉴别：以浓氨水反应、三氯化铝反应、浓流酸反应、 盐酸-镁粉反应、氢硼化钾反应、硅胶薄层色谱法进行定性。 1.2 九龙藤总黄酮含量测定：以黄芩苷为对照品，在波长 278.5nm 处测 定九龙藤提取物甲醇溶液吸光度，代入黄芩苷标准曲线方程得到供试品溶 液中总黄酮的浓度，按下公式计算九龙藤总黄酮与黄芩苷对照品对照所得 的总黄酮含量： 总黄酮含量（%）＝待测液中总黄酮的浓度×待测液体积/待测粗提物重 量×100% 总黄酮提取率（%）＝总黄酮含量×提取物重量(g)/生药量(g) × 100% 1.3 九龙藤总黄酮的提取：在前期研究的基础上，以 95%乙醇冷浸，并 按萃取液极性大小梯度萃取制总黄酮粗品。 1.4 九龙藤总黄酮的纯化方法优化：以静态吸附率和解吸率为考察指 标，确定大孔树脂型号；以总黄酮纯度及回收率为指标，对九龙藤总黄酮 的纯化工艺进行优选。 2.九龙藤总黄酮抗心肌过氧化损伤作用 建立 H2O2 诱导乳鼠心肌细胞过氧化损伤模型与乳鼠心肌细胞 H/R 损伤 PAGE PAGE 2 模型，阳性药物组分别以维生素 C(Vit.C，终浓度 100 mg·L-1)、舒血宁（SXN， 终浓度为 100 mg·L-1）预处理，九龙藤黄酮组以不同剂量 BCF(终浓度分别 50、100、200 mg·L-1)预处理。用 MTT 法检测细胞活力；Annex v-FITC/PI 双染法测定心肌细胞凋亡率；ELISA 法测定细胞培养上清液肿瘤坏死因子 （TNF-α）、总抗氧化活力（T-AOC）、总超氧化物歧化酶（T-SOD）、乳酸 脱氢酶（LDH）、丙二醛（MDA）、一氧化氮合酶（NOS）、还原型谷胱甘 肽（GSH）含量（活性）；免疫组化方法观察 Bcl-2、Bax、NF-κβp65 蛋白 的表达。 结果： 1. 优化九龙藤总黄酮纯化工艺条件 确定以 D101 型