利用重组钝齿棒杆菌高效合成L-茶氨酸-微生物学报.PDF

微生物学报 Acta Microbiologica Sinica 2016, 56(10): 1595-1605 /actamicrocn DOI: 10.13343/ki.wsxb Research Paper 研究报告 利用重组钝齿棒杆菌高效合成L-茶氨酸 * * 和斐，杨套伟，徐美娟，张显，饶志明 ，唐蕾 江南大学工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡 214122 摘要： 【目的】构建Bacillus subtilis来源的γ-谷氨酰转肽酶蛋白(GGT) 的Corynebacterium glutamicum SYPA5-5表达系统，验证该蛋白信号肽片段在宿主表达体系中的作用，并将该体系应用于高效合成茶氨 酸的研究。【方法】将该ggt基因和切除信号肽的片段基因(∆sp ggt)在C. glutamicum SYPA5-5中克隆表 达。以C. glutamicum SYPA5-5高产L-精氨酸培养基为基础进行重组菌产酶优化。最优转化条件为：L-谷 氨酰胺∶乙胺为1 ∶3 ，酶量为0.06 U/mL 。采用底物流加策略高产L-茶氨酸，40 mL 的转化体系包含：终 浓度为0.9 U/mL的GGT ，pH 10 ，37 °C ，从0 h开始每隔2 h补加20 mmol/L 的L-谷氨酰胺，60 mmol/L的乙 胺。【结果】C. glutamicumSYPA5-5/pXMJ19-ggt 发酵上清液中GGT酶活达到(4.69±0.34) U/mL ，C. glutamicum SYPA5-5/pXMJ19-∆sp ggt 只检测到胞内酶活(0.99±0.17) U/mL ，说明利用B. subtilis来源的信号 肽可以实现GGT在C. glutamicum体系中分泌表达。最适产酶培养基条件为：葡萄糖浓度为10%；IPTG最 适添加时间为0 h 。批次流加在12 h时达到最大茶氨酸产量104.36 mmol/L，转化率为86.9%。【讨论】本 文首次实现B. subtilis来源的γ-谷氨酰转肽酶基因(ggt)在C. glutamicum SYPA5-5中分泌表达，通过分批流 加底物获得目前报道的利用重组C. glutamicum合成L-茶氨酸的最高产量。 关键词：L-茶氨酸，γ-谷氨酰转肽酶，钝齿棒杆菌，信号肽，批次流加 L-茶氨酸，化学名称为N- 乙基-γ-L-谷氨酰胺， 管理局 (FDA) 已经认证L-茶氨酸为一般公认安全 [ 1] 是1种几乎只存在于茶类植物中的游离氨基酸 ， 的物质 (GRAS) ，在食品中的使用有特定用量限 决定茶叶的风味和品质。茶氨酸具有多种重要的 制。鉴于茶氨酸上述诸多生理功效及其绝对安全 [2] [3] 生理功能：放松减压作用 ；降血压作用 ；抑制 性，其作为一种食品组分及饮品添加剂的需求量 [4] [5] 咖啡因引起的兴奋反应 ；提高学习能力 ；抗肿 日益增加。进入21世纪，酶法转化合成以其优越 [6] [7] 瘤 ；控制体重 等。早在1985年美国食品和药物 性日益受到青睐，因此研究人员重心也集中于酶 基金项目：国家高技术研究发展计划(2015AA021004)