western blot实验 教学课件.ppt

多克隆抗体 单克隆抗体 来源 小鼠，大鼠，兔子，羊等 鼠源性，兔源性 特点 来源广泛，制备容易 纯度高、特异性强、效价高、少或无血清交叉反应 问：1、如何判断二抗是否有问题及如何快速摸索最佳二抗浓度？ 采用斑点法。 2、如何摸索一抗最佳浓度？ 3. 内参的使用 ――WB过程监测以及目的蛋白定量的标准！ 抗体孵育注意事项： 1、如果背景不是很高，很多抗体在含有低浓度BSA或脱脂奶粉（0.25-0.5%）的稀释液中会有很好的信号。 2、二抗选择：根据一抗来源种属以及抗体Ig亚型选择合适的二抗。比如，如果一抗是小鼠IgG 来源的抗体，二抗需选择抗小鼠IgG 的；如果一抗是小鼠IgM来源的抗体，则二抗要选择抗小鼠IgM的。 显色分析 七 1. 显影方法 显色方法 代表类型 特点 酶促底物显色法 BCIP/NBT显色 DAB显色 稳定性好，灵敏度较低（250pg），背景一般，成像性较差。BCIP对人体有刺激性，NBT对人体有害，请注意适当防护。 化学发光法 （推荐使用） ECL发光法 稳定性好，灵敏度高（10-12g），背景可以很低，成像性好，且可以重复标记， 底物孵育和显影 化学发光法(ECL): 灵敏度高，已经成为一种使用趋势，推荐使用。 显色法：操作简单、无需暗示等曝光设备。 1、打开仪器预热(提前30分钟），暗箱底座擦干净，铺上保鲜膜，保鲜膜下适当加点水使贴住。 2、打开程序-放置凝胶，调整大小及位置。 3、关闭电灯，按1：1取等量的ECL发光液 （A、B两液）混合配置化学发光液，现配现用。 4、显影液完全覆盖住PVDF膜，反应1 min， 点击运行，尽量避光操作 2. 化学发光成像 Western检测取决于： 抗原含量 转膜效率 一抗敏感度 二抗敏感度 底物敏感度 显影、定影效率 推荐：Stripping buffer（pierce） 不需反复作WB的选择 无须反复电泳和转膜，节省宝贵时间 节省珍贵的样品 在不损伤蛋白的基础上，剥离一抗和二抗 一份样品，一次电泳，一次转膜，多次印迹，更多数据 PVDF才可以；NC膜不能用此方法。 45K Beta-actin 45K 35K GAPDH 高背景 信号弱或者无信号 非特异性条带 信号下降太快 常见问题分析 常见问题分析 常见问题分析 常见问题分析 常见问题分析 附录-常用试剂的配制 Thanks! * 凡表面活性剂溶于水时，能电离生成离子的就叫离子型表面活性剂 。 破坏蛋白质的次级键，如氢键、盐键和疏水力，引起天然构象的解体；它们并不破坏共价键，如肽键和二硫键，故不涉及一级结构的改变。变性剂有溶解型和沉淀型两类，SDS、尿素和胍盐是有效的溶解型变性剂，而三氯乙酸、甲醇、和氯仿/异戊醇是有效的沉淀变性剂。 * * 半干转 用滤纸吸buffer来做转移体系的转移方法； 适合转移小分子量的蛋白；200 KD以上不能做； 半干转的电流大小是按照面积来算的，时间是根 据蛋白分子大小定的； 用１０Ｖ转，根据分子量摸索转膜时间 湿转 将膜、胶、滤纸整个浸泡在buffer的Tank里转移 的方法； 适合转移大分子量（100KD以上）蛋白； 湿转时间也是根据分子量而定； 转移方法 +阳极 海棉 滤纸 凝胶 PVDF膜 滤纸 -阴极 电泳完取下玻璃板 清水冲洗胶板 放在桌面上，用滤纸垫下面，小心用刮刀把上层玻璃橇开 将浓缩胶轻轻刮去，根据marker和指标分子量的大小，刮板或小刀切下所需要范围内的胶。 剪好滤纸及PVDF膜，PVDF膜用甲醇先泡1min活化，凝胶须在电转印缓冲液中平衡15min，除去电泳过程中所带的盐；在转印过程中，这些盐会引起转印缓冲液导电性升高，产生大量的热。 准备好海棉、滤纸，转膜夹放在搪瓷盘里 黑色面朝下，先放海棉 依次把三层滤纸、凝胶、PVDF膜放好，膜做上记号，剪滤纸和膜时一定要戴手套，因为手上的蛋白会污染膜。 用玻棒把气泡赶出 再叠三层滤纸 盖上海棉 扣好转膜夹，做好标记， 将其垂直插入缓冲液槽中，确定转印夹黑色面对应于黑色电极将夹子放在槽中， 倒入提前预冷的转膜液，电转移时会产热，但是甲醇要现加。 在槽的一边放一块冰来降温， 放入冰浴中，盖好盖子，按100v恒压在冰浴中转膜，转印结束后，取下转印夹，拆卸凝胶三明治装置，TBST清洗印迹膜。 1、将转膜液放在冰箱里预冷，剪好滤纸及PVDF膜，将转膜夹放在盘中，黑色朝下，倒入转膜液。 2、凝胶须在电转印缓冲液中平衡15min，除去电泳过程中所带的盐；在转印过程中，这些盐会引起转印缓冲液导电性升高，产生大量的热。 3、卸下胶板放在转膜液中，轻轻拿掉短板，将浓缩胶轻轻刮去，根据marker和指标分子量