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* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 基因组测序策略 基因组计划的最终目标是获得所研究的生物的完整的DNA顺序。最佳状况是将物理图谱和遗传图谱进行有机整合，以便于确定基因以及其他重要的序列在DNA顺序中的位置。 有了高密度的基因组图谱，就可以开始全基因组测序了 这里主要介绍基因组测序中所采用的方法和策略。 基因组测序与序列组装 主要内容： DNA测序的方法 DNA顺序的组装 DNA测序的两种方法： ? 链终止法（the chain termination method） 单链DNA分子的序列由与之互补的多核苷酸链的酶促合成来判定，互补链在某一特定的核苷酸位置终止。 ? 化学降解法（chemical degradation method） 双链DNA分子被化学物质修饰后，在特定核苷酸位置被切开，从而确定DNA分子的序列。 Sanger 双脱氧链终止DNA测序法： 利用DNA聚合酶和双脱氧链终止物测定DNA核苷酸顺序的方法，是由英国剑桥分子生物学实验室的生物化学家F. Sanger等人于1977年发明的。 1980年诺贝尔奖金获得者F. Sanger 双脱氧链终止法测序 (the chain termination method) 又叫Sanger 测序法 基本原理： 通过合成与单链DNA互补的多核苷酸链，由于合成的互补链可在不同位置随机终止反应，产生只差一个核苷酸的DNA分子，从而来读取待测DNA分子的顺序。 测序的技术路线与要求 制备单链模板 ↓ 将单链模板与一小段引物退火 ↓ 加入DNA多聚酶4种脱氧核苷酸 分别加入少量4种双脱氧核苷酸 ↓ 将4种反应产物分别在4条泳道电泳 ↓ 根据4个碱基在4条泳道的终止位置读出基因序列 用于终止反应的双脱氧核苷酸： 将2’ ，3’ –双脱氧核苷酸（ddNTP）参入到新合成的DNA链中，由于参入的ddNTP缺乏3’-羟基，因此不能与下一位核苷酸反应形成磷酸二酯键，DNA合成反应将中止 DNA测序的常用方法 基于Sanger测序法，发展起来自动测序法 自动化测序 基本原理： 与链终止法测序原理相同,只是用不同的荧光色彩标记ddNTP,如ddATP标记红色荧光, ddTTP标记绿色荧光,ddCTP标记蓝色荧光, ddGTP标记黄色荧光。由于每种ddNTP带有各自特定的荧光颜色,而简化为由1个泳道同时判读4种碱基. 以荧光化合物标记双脱氧核苷酸的自动测序 荧光化合物标记链终止法以荧光颜色为标记信号，每种ddNTP各有1种代表颜色；整个反应在一个试管中进行；当新合成的终止单链通过荧光监测仪时，可由光信号读出末端核苷酸并由电脑记录。 DNA顺序的组装 基因组的每条染色体长度可达数百万碱基对以上，将链终止法阅读的小片段DNA组装成真实的排列顺序是一项浩繁而精细的工作。 DNA顺序的组装策略 主要有两种策略将大量短的DNA顺序组装起来，鸟枪法及克隆重叠群法。 大 规 模基因组 测 序 的 两 种 策 略 克隆重叠群法 （Clone by Clone）---自上而下 鸟枪法（全基因组霰弹法 ） （Whole Genome Shot-gun) ---自下而上 鸟枪法（shotgun） 什么是鸟枪法？鸟枪法，也俗称“霰弹法”，是随机先将整个基因组打碎成小片段进行测序，最终利用计算机根据序列之间的重叠关系进行排序和组装，并确定它们在基因组中的正确位置。 自下而上的测序方法  随机测序与序列组装-鸟枪法 鸟枪法的顺序组装是直接从已测序的小片段中寻找彼此重叠的测序克隆，然后依次向两侧邻接的序列延伸。这一方法不需要预先了解任何基因组的情况，即使缺少遗传图谱和物理图谱，也可以完成整个基因组的组装。 优点:不需预先了解任何基因组的情况。 缺点：不适合大基因组测序。 鸟枪法 （a）DNA分子被打断，产生小片段DNA （b）小片段DNA分别测序 （c）根据DNA序列的重叠关系，构建重叠群 AGCCAATGCATTAGC…… ……ATGCAGCCAATGCAT 重叠群 DNA序列 小片段DNA DNA分子 鸟枪法序列组装 鸟枪法的优势： 鸟枪法的主要优势在于：测序速度快，并且无须提供相关的遗传图谱和物理图谱。 20世纪90年代末，用鸟枪法在较短时间内成功地完成了流感嗜血杆菌的基因组测序，引发了一场微生物基因组测序的热潮。这些研究项目的实施，表明鸟枪法测序可以组建一