胶原-壳聚糖胶原-纳米羟基磷灰石仿生支架复合BMSCs体外构建组织工程骨软骨的前期实验研究-外科学(骨外科)专业论文.docxVIP

福建医科大学 福建医科大学 2011 届硕士研究生毕业论文 PAGE PAGE 10 胶原-壳聚糖/胶原-纳米羟基磷灰石仿生支架复合 BMSCs 体外构建组织工程骨软骨的前期实验研究 中文摘要 【目的】 1．分离、培养扩增和鉴定猪BMSCs。 2．构建TGF-β1重组慢病毒表达载体，并转染BMSCs，为骨软骨组织工程修 复提供持续高效的种子细胞。 3.制备胶原-壳聚糖/胶原-纳米羟基磷灰石支架材料并检测其生物相容性。 【方法】 1．分离、培养扩增和鉴定猪BMSCs：联合应用密度梯度离心法及贴壁培养法 分离、培养扩增猪BMSCs，并应用流式细胞仪鉴定BMSCs表面相对特异性分子 (CD90、 CD105、 CD45 )的阳性率以明确BMSCs的纯度。 2．构建TGF-β1重组慢病毒表达载体，并转染BMSCs：将已提取的目的基因 TGF-β1cDNA包装至慢病毒载体中，通过PCR及基因测序对阳性克隆进行鉴定，并 用Real-time PCR检测慢病毒滴度；利用TGF-β1重组慢病毒转染BMSCs，通过 Western blot、RT-PCR，免疫细胞化学、Elisa等方法检测TGF-β1基因及蛋白在 BMSCs中的表达情况，以明确转染效果。 3. 制备胶原-壳聚糖/胶原-纳米羟基磷灰石支架材料并检测其生物相容性： 由清华大学研发和制备出胶原-壳聚糖/胶原-纳米羟基磷灰石支架材料，并依据 相关标准选择急性全身毒性试验、皮内刺激试验、热原试验、溶血试验、体外细 胞毒性试验及骨植入试验检测胶原-壳聚糖/胶原-纳米羟基磷灰石支架材料的生 物相容性。 【结果】 1.联合应用密度梯度离心法及贴壁培养法成功分离、培养扩增猪BMSCs，流 式细胞仪检测细胞表面相对特异性分子的阳性表达率显示：CD90为91.2%，CD105 为93.5%，CD45为4.4%。 2.经PCR及基因测序鉴定TGF-β1重组慢病毒表达载体构建成功，测定滴度为 2×109TU/ml；以慢病毒为载体，将TGF-β1基因导入猪BMSCs，经Western blot、 RT-PCR、免疫细胞化学及Elisa提示TGF-β1基因成功导入BMSCs，并表达TGF-β1 蛋白。 3. 胶原-壳聚糖/胶原-纳米羟基磷灰石支架材料的急性全身毒性试验、皮内 刺激试验、热原试验、溶血试验、体外细胞毒性试验均符合相关标准，骨植入试 验显示支架材料与周边组织相容性好。 【结论】 1.联合应用密度梯度离心法及贴壁培养法可以获取纯度较高的猪BMSCs。 2.成功构建TGF-β1重组慢病毒表达载体，并成功转染BMSCs，TGF-β1基因 可长期、稳定表达。 3.成功制备出生物相容性良好的胶原-壳聚糖/胶原-纳米羟基磷灰石支架材 料。 【关键词】 骨髓间充质干细胞；TGF-β1；支架材料；生物相容性；骨软骨缺损；组织 工程；基因治疗 Primary Experimental Study on In vitro Construction of Tissue-engineered Osteochondral Composite Using A Combination of Biomimetic Scaffold Col-CS/ nHAC-PLA and Bone Mesenchymal Stem Cells Abstract [Objective] To isolate, expand and identify porcine BMSCs. To construct recombinant lentivirus vectors of TGF-β1 gene and transfect BMSCs. providing efficient and sustained cells for bone and cartilage tissue engineering. To prepare Col-CS/ nHAC-PLA scaffold and examine its biocompatibility. [Methods] Isolation, expansion and identification of porcine BMSCs：Mononuclear cells were isolated from bone marrow by density gradient centrifugation, and then BMSCs were extracted by adherence characteristics and expanded by subculture. BMSCs were identified by flow cytometry to determine the