酵母组蛋白修饰因果关系的实验检验-生物学(植物学)专业论文.docxVIP

内蒙 内蒙古科技大学硕士学位论文 万方数据 万方数据 摘 要 核小体是染色质的基本结构单位，而组蛋白是核小体重要组成成分。核小体组 蛋白 N 末端尾部可以发生多种共价修饰，比如甲基化、乙酰化和磷酸化等。这些组 蛋白修饰对于基因表达具有调控作用。“组蛋白密码”假说认为多种组蛋白修饰能够协 同影响基因表达。同时，一些研究发现多种修饰之间存在因果关联关系。 为了研究酿酒酵母组蛋白修饰之间的因果组合关系，前期分别以 Liu 等和 Pokholok 等建立的酿酒酵母组蛋白修饰数据库为基础，通过构建组蛋白修饰贝叶斯 网络等一系列理论方法，预测了修饰之间的因果关系。本文的研究内容是基于之前 的理论研究，对其中部分修饰关系进行实验检验，包括组蛋白修饰 H3K14Ac 与 H3K4me3 、 H3K14Ac 与 H4K12Ac 、 H3K14Ac 与 H3K9Ac 、 H3K14Ac 与 H3K18Ac、H3K14Ac 与 H3K36me3 和 H3K14Ac 与 H3K79me3 等之间的因果关系。 具体工作如下： 首先构建 H3K14A、H3K9A、H4K5A 和 H4K12A 等突变菌株。酵母组蛋白 H3 基因（HHT1 和 HHT2）和 H4 基因（HHF1 和 HHF2）在细胞中分别有 2 个拷贝， HHT1 和 HHF1 位于 II 号染色体，HHT2 和 HHF2 位于 XIV 号染色体。第一步通过 NatMX4 抗性标记基因替换 HHT1 和 HHF1 基因。在此基础上，进一步通过同源重组 的手段将酿酒酵母菌中 XIV 号染色体上组蛋白 H3 和 H4 基因（HHT2 和 HHF2）敲 除。具体步骤是使用质粒小提试剂盒提取质粒，并对所提取的质粒使用 Bci VI 酶 切，然后将酶切产物（含有突变位点的 DNA 片段）转化已完成 HHT1 和 HHF1 敲除 的酿酒酵母细胞，再用 Sc-Ura 平板筛选转化成功的酵母细胞。通过 PCR 鉴定 H3K14A、H3K9A、H4K5A 和 H4K12A 变体菌，后对 PCR 产物进行测序，结果表明 变体菌构建成功。 然后通过 Western Blot 实验检测上述四种突变体和相应的对照菌株的 H3K9Ac、 H3K18Ac、H4K12Ac、H3K4me3、H3K36me3 和 H3K79me3 修饰。结果显示修饰 H3K14Ac 与 H3K4me3、H3K14Ac 与 H3K18Ac、H4K12Ac 与 H3K79me3 之间存在 因果关系，这些被验证的因果关系与前期的网络结果吻合。 最后，Western Blot 结果显示 H4K12A 突变体中 H3K79me3 抗体蛋白印迹较浅， 预示着它们之间的因果关系在基因组可能存在区域性，即该变体的 H3K79me3 修饰 I 只是在基因组某些区域存在。采用 ChIP-Seq 方法对 H4K12A 突变体中的 H3K79me3 修饰进行了基因组分布研究。首先检验超声后得到的样品（2 个野生菌株、2 个变体 菌株）片段（100-400 bp），之后对片段长度符合要求的样品进行特异性免疫沉淀反 应，再对解交联和纯化的 DNA 进行 PCR 验证。结果显示纯化后的样品 DNA 片段均 为 200 bp 左右，最后对这些样品进行测序。 关键词：组蛋白修饰；甲基化；乙酰化；因果关系 II Abstract Nucleosome is the basic unit of chromatin. Histones are important components of nucleosomes. N-terminal tails of nuclear histones may occur mutiple covalent modifications, such as methylation, acetylation, phosphorylation, and so on. These modifications of the histones may regulate gene expression. Histone code hypothesis suggests that multiple histone modifications can cooperatively affect gene expression. Meanwhile, some studies have found the causal relationship between various modifications. In order to study the causal relationships between histone modifications in yeas