酵母系统超量生产代谢中间物和外源基因产物的应用基础研究-生物化工专业论文.docx

摘 摘 要 酵母是自然界中分布最广泛、与人类关系最密切、也是最安全的微生物之，， 已经在传统发酵工业和现代生物技术中发挥了重要的作用。本文深入研究了利用 酵母菌中的酶系超量合成代谢中阳J物果糖．1，6．：磷酸(FDP)的过程，考察了利 用重组酵母高效表达外源蛋白质鼠q一淀粉酶和莫内林的基本规律，优化了工艺过 程，为上述过程的研究丌发提供了理论指导和丰富的基础数据。 1．酵母细胞代谢调节超量生产FDP 研究了酵母细胞代谢调节积累FDP的机理和生物反应工艺，考察了改变代谢 途径、使酵母细胞大量积累FDP的细胞膜透性化调节方法；系统研究了环境条件 如温度、pH、糖、无机磷、金属离子和溶解氧等对代谢调节效果的影响，优化了 工业酵母细胞生物转化积累FDP的反应工艺条件。在此基础上建立了生物转化合 成FDP的补料分批操作方式，以产品成本最低为目标优化了反应操作时间。当补 加糖和无机磷时FDP积累最大浓度达1 35．65∥J，对糖收率为28．2％。 对透性化酵母细胞积累FDP的糖代谢途径和代谢流展开了深入研究，分析了 酵母细胞合成并积累FDP的机理。测定了生物转化过程中底物、代谢中问物、代 谢产物的变化规律，建立了透性化酵母糖代谢并积累FDP的代谢途径模型。应用 代谢通量分析(MFA)原理分析了FDP积累过程细胞代谢的动力学特征，表明透 性化酵母细胞积累FDP是细胞内ATPase失活、糖酵解(EMP)途径和乙醇支路 及甘油支路的联合作用造成的。磷酸果糖激酶(PFK)是代谢途径的一个速率控 制位点，但限速的原因不是由于底物6．磷酸果糖(P6P)浓度低，而是另 底物 ATP不足引起；丙酮酸激酶(PK)是控制代谢通量分布的刚性结点，PK通量限 制导致代谢朝甘油支路分流，是引起ATP不足、FDP收率下降的根本原因。反 应积累的FDP作为PK的激活剂，反过来成为调节代谢通量分布、影响FDP收 率的重要因素。 研究了分离提纯FDP新工艺路线。建立了锌盐沉淀去除酶转化液中残尉无机 磷酸并沉淀回收FDP的新工艺，辅以离子交换树脂解离和有机溶剂结晶操作，分 离得到的FDPHNa3纯度为86．17％，分离收率达52．24％。 2．重组酿酒酵母超量生产外源蛋白质 以重组酿酒酵母分泌表达鼠Ⅱ．淀粉酶为研究对象，研究了启动子SUC2受碳 源葡萄糖浓度调控、稳定外源基因的选择性标记为营养缺陷互补(豫P)的情形 F，高效分泌表达基因产物0【．淀粉酶的规律。 埘凋控外源蛋白质分泌表达的适宜J：艺条件进行了实验研究。为了诱导琏冈 产物分泌表达，除消除底物葡萄糖对诱导型启动子SUC2抑制外，还需要营养# 产物分泌表达，除消除底物葡萄糖对诱导型启动子SUC2抑制外，还需要营养# 富的天然氮源支持，其中以酵母膏、玉米浆较为适宜。合适的细胞生长期碳氮【E， ¨J为诱导表达阶段提供活力日i：盛的重组酵母细胞、降低质粒稳定性下降趋势，当 碳氮比为C／N=5：1～4：1时，取得了较好的培养效果。溶解氧浓度(DO)过关系表 达效率的又‘重要因素，实验结果表明，DO应保持高于1．5 mg／l。 重组酿酒酵母分泌表达外源蛋白质需要添加营养丰富的天然氮源，这·I保持 质粒稳定的选择性压力一一负色氨酸环境相矛盾。正确处理这一矛盾是设计该类 重纠i茼培养一艺的关键。利用诱导型启动子(sue2)的调节作用进行分段培养， 是解决矛硒的对策之一。本工作采用了在选择性压力下增殖菌体，然后添加天然 氮源(同时连失选择性压力)诱导外源蛋白质生产的两段培养策略。分段培养时， 初糖浓度对诱导时刻具有决定作用，合适的诱导时间应为菌体生长达到对数增殖 后期。发现乳酸町替代葡萄糖作碳源在诱导期支持重组酵母生长和基因表达，并 建立了通过pH控制乳酸浓度连续流加乳酸的分段培养工艺，在1升搅拌发酵罐 培养重组酵母菌株，最大鼠仪．淀粉酶活力达79 U／ml。进一步研究了无选择性压 力下质粒的竞争性不稳定规律，发现质粒保持率在营养缺乏的生长静止期和脉冲 添加营养物的情形下呈提高趋势：据此，设计了恒流量流加营养物、同时脉冲补 加酵母膏的营养物脉冲高密度流加培养工艺，提高了质粒稳定性，使重组酵母培 养中含质粒细胞比例高于90％。通过上述研究工作，使最大菌体密度和鼠旺．淀粉 酶活力分别提高到36 g／l和208 U／ml。 3．重组酵母Candida utilis超量生产甜味蛋白质 在搅拌发酵罐中研究了重组酵母C utilis超量生产甜味蛋白质莫内林的高密 度培养工艺。由于莫内林是胞内表达产物，提高重组酵母C．utilis培养的密度就 成了提高莫内林生产水平的关键。 通过考察菌体对碳、氮、磷源和微量元素B”，Cu”，Fe”，I。，Mn”，Mo”，Zn” 等的得率，确定了流加营养物的最佳配方。通过营养物流加培养，使菌体密度达