酵母乙酸异戊酯水解酶和V型ATP酶F亚基的结构生物学研究-生物化学与分子生物学专业论文.docx

7 7 flllflll rlllfllrllJ／[1 lfllIJI／fllJlIJlllffIJ舢 Y1 8 1 676 1 University of Science and Technology of China A dissertation for doctor’S degree 中国科学技术大学学位论文原创性声明本人声明所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行研究工作所取得的成 中国科学技术大学学位论文原创性声明 本人声明所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行研究工作所取得的成 果。除已特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含任何他人已经发表或撰写 过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究所做的贡献均已在论文中作了明确 的说明。 作者签名： 至垒!!丝 签字日期：兰塑：：生：!Z 中国科学技术大学学位论文授权使用声明 作为申请学位的条件之一，学位论文著作权拥有者授权中国科学技术大学拥 有学位论文的部分使用权，即：学校有权按有关规定向国家有关部门或机构送交 论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文编入有关数据 库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。本人 提交的电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 吆开 口保密(——年) 作者签名： 蔓坌：生 导师签 签字日 摘要摘要 摘要 摘要 (I)酿酒酵母乙酸异戊酯水解酶结构与功能研究：在酿酒酵母发酵过程中产 生的酯类化合物，是决定酒的香气与风味的主要成分。乙酸异戊酯水解酶 (Isoamyl Acetate．Hydrolyzing esterase，IAHl)是酵母发酵过程中酯类化合物代 谢的一个关键酶，它与醇乙酰基转移酶(alcohol acetyrltransferase，ATFase)共通 调控着异戊醇与乙酰辅酶A缩合生成乙酸异戊酯的过程。 我们从酵母基因组中克隆了乙酸异戊酯水解酶基因，构建了pET22b载体的 重组质粒。表达纯化并结晶了IAHl，在本实验室室内光源收集了一套分辨率为 1．60A的晶体衍射数据。同时，表达、纯化并结晶了IAHl硒代甲硫氨酸衍生物 蛋白，在北京同步辐射3W1A线站收集了三套MAD数据，分辨率均为2．05A。 然后通过MAD法，解析了IAHl晶体的衍射相位，并最终获得了1．6A的高分辨 率晶体结构模型。 通过对IAHl晶体结构的分析，我们确定了其酶学分类，属于SGNH．hydrolase 家族。与同源结构比对后发现，它们的中央p．折叠片和催化活性残基在结构上高 度保守。IAHl是该家族中目前发现的唯一的以二体形式存在的蛋白，同时IAHl 与其它成员相比，又含有三个独特的插入序列，且具有各自的生物学功能。 IAHl在晶体和溶液中均以二体存在，实验证明其同二聚体对于蛋白的酶活 性和底物特异性有着重要的意义。IAHl所特有的一段C-temimus通过二聚化参 与了二聚体中另一亚基酶活性口袋的形成，限制了底物进入酶活中心的路径。 IAHl的活性口袋可以根据其功能分为三层，其中催化三联体所在的中间层 催化水解反应的进行，上层与下层结合酯类的疏水性侧链。通过结构模型的分析， 推测底物进入活性口袋后，其长的疏水性侧链应当更加倾向于留在活性口袋的上 部，甚至延伸至溶剂区。进一步推测Lys52和Trpl29可以在底物进入活性中心 后，提供疏水性位点结合底物的侧链，对于IAHl的酶活与底物特异性有着重要 的意义。 关键词：酯酶：SGNI-I．水解酶家族；IAHl；C末端；活性中心；催化三联体； 底物特异性 (II)酵母V-ATPase F亚基(VMA7)的初步晶体学研究：Vacuolar I-F．ATPase， 或V-ATPase，广泛存在于真核细胞的细胞质膜和细胞器膜系统中，它依赖分解 ATP产生的能量作为动力，可以逆浓度梯度将质子泵出细胞外或泵入细胞器内 { 摘要腔，是细胞内囊泡膜系统中最重要的质子泵，对于控制和调节细胞的pH值有着 摘要 腔，是细胞内囊泡膜系统中最重要的质子泵，对于控制和调节细胞的pH值有着 极其重要的生理意义。 V-ATPase是一种多亚基复合物，全酶有十几种小亚基组成。这些小亚基组成 了两个大的结构域，一个是具有ATP水解酶活性的膜外结构域V1，一个是负责 质子跨膜运转的膜内结构域vo。Vl与Vo之间通过一个中央柄轴结构相连。在酵 母中，这一中央柄轴结构由VMA7(F亚基)和VMA8(D亚基)组成，对于 V-ATPase全酶的组装和运转有着关键的作用。 我们从酵母基因组中克隆了V-ATPase的F亚基(VMA7)基因，并成功构 建了pETDuet载体的重组质粒。表达并纯化了VMA7重组蛋白。利用悬滴气相 扩散法