酵母双杂交系统筛选CTCF相互作用蛋白-生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

四川大学硕士学位论文 四川大学硕士学位论文 作者杨博 导师覃扬 教授 中文摘要 酵母双杂交系统筛选CTCF相互作用蛋白 生物化学与分子生物学争业 研究生杨博 指导教师覃扬教授 背景和目的 基因组印记(Genomic imprinting)是一种配子发生过程 中对某些基因不同亲本来源的等位基因进行差别标记的现象，研究表明基 因印记表达异常是某些恶性肿瘤重要的分子生物学特征，印记的改变可能 是肿瘤发生中的重要环节。CTCF(ccctc binding factor)是基因组印记调 控中发挥重要作用的一类蛋白质，编码CTCF的基因定位于16q22，是一 类在哺乳动物中广泛表达的高度保守的核蛋白，它可以和启动子，激素反 应性基因沉默子，隔离子以及基因组印记相关元件等结合，在基因后成修 饰，细胞生长和x染色体沉默等过程中有广泛作用。CTCF因其在肿瘤中 常常发生功能缺失而被认为是一种候选抑癌基因。CTCF作为一个有如此 丰富功能的蛋白质，不难让人联想到其是一个复杂的核酸蛋白质相互作用 体系中重要的一环，如此多样的功能的完成也决不是独立进行的，其必然 有众多的其他元件共同完成这些功能。本室前期研究亦发现人原发性肝癌 IGF2基因印记异常，同时发现CTCF在其中具有重要作用，为进一步探讨 CTCF及其相互作用蛋白调控人肝IGF2基因印记的机理，以及探讨在人肝 四川大学硕士学位论文 四川大学硕士学位论文 作者杨博 导师覃扬 教授 癌中恢复16F2基因的正常的可能途径，本课题采用酵母双杂交的方法筛 选正常人肝组织中与CTCF有相互作用的蛋白质。 方法CTCF具完整编码序列的eDNA克隆由美国纽约大学w．w．Quitschke 教授惠赠，经对CTCF完整编码序列的旁侧多克隆位点的适当修改，使其 与质粒载体pGBKT7连接重组为诱饵质粒pGBKT7／CTCF，保持了正确的读 码椎架。通过检测转化诱饵质粒的酵母AHl09在SD／-Trp，SD／一Ade／一Trp， SD／一His／一Trp，SD／一Leu／一Trp固体培养基上的生长情况，判定是否有自 激活发生，并鉴定了重组诱饵蛋白的毒性。以转化诱饵质粒的酵母Attl09 菌株与人肝cDNA酵母文库进行杂交以筛选有相互作用的酵母克隆，同时 进行了文库滴度测定和杂交效率测定。依次在三缺培养基上，四缺培养基 上培养和筛选，以及用13一半乳糖苷酶印膜法检测阳性克隆内lacZ报告基 因的表达，对双杂交杂合子进行验证和筛选，获阳性酵母克隆。然后提取 阳性酵母克隆质粒， 采用通用引物PCR扩增酵双杂交阳性酵母克隆中与 pGADT7同源重组的人肝cDNA片段，并采用HaelII限制性内切酶进行分 类分析，将所有阳性克隆酵母质粒全部转化大肠杆菌Dtt5 d，并提取质粒 重复PCR及酶切分析，验证了阳性克隆的正确性，同时减少了克隆的重复。 根据PCR及酶切分析结果在70个阳性克隆中选取六个阳性克隆进行测序。 结果重组穿梭质粒pET-28a(+)／CTCF经EaoR I与Nao I酶切鉴定构建 成功，CTCF读码框架正确。重组诱饵质粒pGBKT7／CTcF经BamHl和Sal I 双酶切及基因测序鉴定证实构建成功，CTCF读码框架正确。诱饵蛋白实 验证实无自激活作用，对酵母AHl09菌株无毒性。文库的滴度(5×1072 ×107)及杂交效率(6％2％)，符合要求，酵母双杂交后在三缺培养基 上共筛选得到400个阳性克隆，在四缺培养基上继续培养这400个阳性克 隆共筛选得到200个阳性克隆，13一半乳糖苷酶印膜法检测200个阳性克 隆，筛选得到70个阳性克隆。PCR扩增阳性酵母克隆，结果均为阳性， 2 四川大学硕士学位论文 四川大学硕士学位论文 作者杨博 导师卓扬 教授 可见大小不等扩增片段，多介于250bp～2．Okb之间。 结论通过各种筛选验证实验说明以CTCF为诱饵蛋白的人肝eDNA酵母双 杂交系统构建成功，并筛选获得了与CTCF相互作用的酵母阳性克隆及蛋白 质编码基因。 关键词：CTCF：酵母双杂交； 人肝cDNA酵母文库 3 四川大学硕士学位论文 四川大学硕士学位论文 作者杨博 导师卓扬 教授 Engl i sh abstract SCREENING INTERACTIoN PRoTEIN oF CTCF BY YEAST TWo HYBRID SYSTEM Speciality Biochemistry and molecular biology Master candidate Yang，Bo Supervisor Yang,Qin Baekground and Object Genomic imprinting is an epigenetic modification m me germ lin