酵母双杂交方法在研究蛋白酶体中蛋白质相互作用时的局限性-病理与病理生理专业论文.docxVIP

中国协和医科大学硕士研究生毕业论文中文摘要 中国协和医科大学硕士研究生毕业论文 中文摘要 蛋白酶体复合物是细胞质和细胞核中降解蛋白质的主要蛋白酶，它参与许多的生 物过程。真核生物Saccharomyces cerevisiae中20S蛋白质酶体，经X．射线晶体学分 析发现外形为中空的圆柱状，由28个亚基以n 7 B 7 B 7 Q 7形式排列形成的四个环状 结构叠加在一起组成【”。其中的某些内环的B亚基可以形成酶切降解部位，外环的a 亚基的表面与酶切部位有通道相通，那么n亚基是如何发挥作用的呢?我们猜想是通 过和某些蛋白质的相互作用为蛋白酶体降解蛋白质提供选择性。本实验应用酵母双杂 交的方法将人的20S蛋白质酶体的Ⅱ4亚基与OAIA-BD的融合蛋白质作为诱饵，来 筛选人心脏的CDNA文库，希望能够找到一些a亚基是如何发挥作用的线索，实验 结果没有找到与之相互作用的蛋白质。分析原因可能是酵母双杂交方法可能不适合研 究象蛋白酶体这样的大分子复合物。为了验证这一结论我们将x．衍射已经看到的20S 蛋白质酶体的相邻a亚基分别作为诱饵和钓取蛋白质，验证酵母双杂交方法可否检验 到他们之间的相互作用。首先用PCR方法获得相邻a亚基克隆共三对(a卜a 7，a 3一 n 4，a 6一CI 7)，分别连接到BD载体和AD载体上，两两共同转化酵母菌株 GAL4．CGl945，检测每一对相邻亚基之间的相互作用，结果显示三对中都没有显示 相互作用的阳性结果，所以我们相信用酵母双杂交的方法检验蛋白酶体大分子复合物 中单独的亚基之间相互作用可能不适用。大分子复合物可能需要通过多个亚基共同作 用才维持其整体结构和功能，单独拿出其中的某个亚基很难保持原有的相互作用。 中国协和医科大学硕士研究生毕业论文Abstract 中国协和医科大学硕士研究生毕业论文 Abstract Proteasome is the major protease responsible for degradation the vast majority of proteins from both the cytosol and the nucleus and involved in many biological processes． The crystal structure of the 20S proteasome purified from eukaryotic Saccharomyces cerevisiae was determined by X—ray crystallography．It is a hollow cylindrical structure composed of 28 subunits，which are arranged as．an alpha(7)beta(7)beta(7)aipha (7)-complex in four stacked rings．Some inner[3-rings contains the proteolytic active sites． There is a narrow channel leading from the surface of outer∞一rings to the proteolytic sites． But in what way do the∞一subunits work?Perhaps by interacting wim some proteins to offer specificity for proteasome．In this experiment，we used the GAL4一BD—human 20S proteasome％一subunit fusion protein as a”bait”to screen a human heart eDNA library,in order to find clues about the function of cx-subnnit，but we did not find any interaction protein．This result hints that the yeast two—hybrid method may not be suitable for studying the complex like proteasome．In order to test this hypothesis，we used three pairs adjacent ％-subunits(Ⅱ1一Q 7，o 3一n 4，n 6一n 7)seen by X—ray crystallography aS the bait protein a