酵母双杂交技术筛选与CD44相互作用的单链抗体-生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

主要符号对照表 主要符号对照表 I I 主要符号对照表 Ade 腺嘌呤 (Adenine) Amp 氨苄青霉素 (Ampicillin) bp 碱基对（Base Pair） LG- DMEM 低糖 DMEM 细胞培养液（ Low Glucose- Dulbecco’s-modified Eagle’s Medium） FBS 胎牛血清 （fetal bovine serum） bFGF 重组碱性成纤维生长因子（basic fibroblast growth factor） cDNA 互补 DNA（Complement DNA) cfu 菌落形成单位 (Colony-forming unit） DMSO 二甲基亚矾（Dimethyl sulfoxide） DNase I 脱氧核糖核酸酶I（Deoxyribonuclease I） Kan 卡那霉素（Kanamycin） PBS 磷酸盐缓冲液（Phosphate-buffered saline） PEG 聚乙二醇（Polyethylene glycol） X-α-gal 5- 溴 -4- 氯 -3- 吲 哚 -α-D- 半 乳 糖 苷 (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-α-D-galactopyranoside) E.coli 大肠杆菌（escherichia coli） PBS 磷酸盐缓冲溶液(Phosphate buffer solution) PCR 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction) PEG 聚乙二醇(Polyethylene glycol) LB 肉汤培养基（Luria-Bertani） 摘要 摘要 II II 摘 要 CD44 是介导细胞与细胞、细胞与细胞基质间相互作用的多功能 I 型跨膜蛋白，被鉴定 为癌症干细胞的表面标记，在多种肿瘤的发生、发展和侵袭中发挥重要的作用，与肿瘤的 不良预后有关。本研究采用新方法筛选与 CD44 存在相互作用的单链抗体，用于 CD44 的 靶向治疗，即采用酵母双杂交技术从人单链抗体文库中钩选目的抗体。 首先，将 CD44 胞外段基因插入 pGBKT7 质粒的 EcoR I 与 BamH I 位点之间，构建诱 饵质粒 pGBKT7-CD44，然后将诱饵质粒转化酵母 AH109，进行毒性和自激活检测。再将 人单链抗体 cNDA 文库转化已携带诱饵质粒的酵母 AH109，使用营养缺陷型培养基进行筛 选。将得到的 36 个候选阳性克隆进行两轮划线筛选(分别在 SD/–Leu/–Trp/X-α-Gal 和 SD/–Ade/–His/–Leu/–Trp/X-α-Gal 板上划线)及回复性转化实验，以排除假阳性克隆。经过 回转实验后，得到 20 个阳性的 scFv 抗体克隆，分别进行测序分析其 DNA 顺序和抗体结 构。通过哺乳动物双杂交实验鉴定阳性抗体蛋白与 CD44 的相互作用，最后确定单链抗体 CA5 与 CD44 存在相互作用。 综上所述，本研究经过筛选和多重验证，通过酵母双杂交技术从单链抗体文库中筛选 了与 CD44 存在相互作用的抗体蛋白，相信能为研究 CD44 的靶向治疗奠定基础。 关键词：CD44、酵母双杂交、哺乳动物双杂交、蛋白质相互作用 Abstract Abstract PAGE PAGE IV Abstract CD44 is a multifunctional type 1 transmembrane glycoproteins which mediate contact between cells or between cells and the extracellular matrix. CD44 was identified as a cancer stem cell marker, has important effect upon cell proliferation, invasion, and metastasis in many tumours, and correlates with poor prognosis in human tumors.In this study,we isolated single-chain variable fragment agaist anti-CD44 by screening a human single-chain intracellular antibody (intrabody) cDNA library using yeast two-hybrid system. CD44 extracellular domain was inserted into between EcoRI-Ba