酵母双杂交筛选与乙型肝炎病毒剪接特异性蛋白相互作用的肝细胞蛋白-生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

万方数据 万方数据 目 录 中文摘要………………………………………………………………………… 3 英文摘要 ………………………………………………………………………… 4 正文……………………………………………………………………………… 5 前言………………………………………………………………………… 5 材料和方法………………………………………………………………… 6 结果………………………………………………………………………… 24 讨论………………………………………………………………………… 35 结论………………………………………………………………………… 38 参考文献…………………………………………………………………… 39 附录一 英文缩略词表. ……………………………………………………… 42 附录二 试剂配方……………………………………………………………… 43 附录三 主要仪器设备………………………………………………………… 48 致谢……………………………………………………………………………… 49 综述……………………………………………………………………………… 50 2 酵母双杂交筛选与乙型肝炎病毒剪接特异性蛋白 相互作用的肝细胞蛋白 摘要 乙型肝炎病毒剪接特异性蛋白（hepatitis B spliced protein，HBSP）由 2447 nt-489 nt 单剪接型 2.2 Kb HBV 剪接变异体编码产生，与病毒的致病性及持续性感 染相关，但其具体机制尚未阐明。本研究首先利用经典的细胞核酵母双杂交筛选 与 HBSP 相互作用的肝细胞蛋白，共获得 1166 个阳性克隆，进一步在酵母体内进 行验证，去除假阳性和重复克隆后共得到金属硫蛋白（metallothionein-2，MT2）， 乙醇脱氢酶（alcohol dehydrogenase 1A (class I)， alpha polypeptide ，ADH1A）， tRNA 剪接内切酶（tRNA-splicing endonuclease subunit 34，TSEN34），乙酰辅酶 A 酰基转移酶（acetyl-CoA acyltransferase 2 ，ACAA2)等 38 个与 HBSP 相互作用的 猎物蛋白。选取乙醇脱氢酶 1A（ADH1A）验证其与 HBSP 在哺乳动物细胞体内 外的相互作用。为此，构建 pGEX-4T-1-HBSP 载体，转化大肠杆菌并纯化获得 GST-HBSP 融合蛋白，以 RT-PCR 技术从 HepG2 细胞扩增得到 ADH1A 全长基因， 构建 pCMVTN T-ADH1A 载体，体外转录翻译出 ADH1A 蛋白，GST pull-down 实 验证实 ADH1A 蛋白可以和 HBSP 体外相互作用。将 HBSP 重组腺病毒感染肝癌 细胞株，进行内源性免疫共沉淀实验，证实 HBSP 和哺乳动物细胞内源性 ADH1A 具有相互作用。本研究为今后进一步探讨 HBSP 致病性奠定基础。 关键词：乙型肝炎病毒，RNA 剪接， 酵母双杂交，肝细胞 3 Screening for the hepatocyte proteins interacting with hepatitis B spliced protein by yeast two-hybrid assays Abstract The hepatitis B spliced protein (HBSP) encoded by a 2.2 kb singly spliced defective HBV genome has been shown to play an important role in hepatopathogenesis, yet the exact mechanisms remain to be fully elucidated. To screen for hepatocellular proteins interacting with HBSP, a conventional yeast two-hybrid assay was used. 1166 positive clones were preliminary obtained, and the false positive and repeated clones were discarded according to the results of phenotype validation and transactivational ability detection. Finally, 38 positive clones were