酵母双杂交系统用于对虾白斑综合症病毒（WSSV）受体基因的筛选-渔业资源专业论文.docxVIP

酵母取杂交系统用于对虾自斑综台症病毒(WSSv)受体基因的筛选酵母双杂交系统用于对虾白斑综合症 酵母取杂交系统用于对虾自斑综台症病毒(WSSv)受体基因的筛选 酵母双杂交系统用于对虾白斑综合症 病毒(wssv)受体基因的筛选 摘 要 对虾白斑综合症病毒(WSSV)是对虾暴发性流行病的主要病原，严重危害 对虾养殖业。病毒入侵宿主首先要和其对应的特异受体结合，深入了解wSSV 感染机制，找到编码受体的基因，无疑对病害的防治具有基础性意义。本实验 利用酵母双杂技术进行了受体筛选的初步研究工作。 作者利用SMART fSwitching Mechanism 5 end ofRNA Transcript)技术， 以同源重组的方式构建了中国明对虾鳃细胞的全长eDNA文库。首先用RNA 提取试剂盒从中国明对虾鳃细胞中提取总RNA，以总RNA为模板，CDS IlI oligo(dT)为引物，反应一段时间后，再加入转换模板(switchingtemplate)，继续 反应，反转录合成eDNA第一链。再在DNA聚合酶下，通过长距离PCR，扩 增双链DNA。双链eDNA经凝胶过滤柱纯化后，与线性化的pGADT7一Ree质 粒载体同源重组，转化感受态AHl09酵母菌株后，得到中国明对虾鳃细胞的 全长eDNA文库。经测定该文库的容量为2．1x106，扩增后文库的滴度为 7．3×10 7cfu／ml，菌落PCR测定，该文库的重组率为90％，可用于下一步的筛选 研究。 对两个被认为有粘附活性的WSSV囊膜蛋白VP281、VP28做了融合质粒 的构建。在WSSV全基因组中，针对VP28和VP281基因特定位点，用Primer Premier软件分别设计了一对引物，并引入Nde 1和Pst I酶切位点，PCR扩增 后，酶切、纯化，定向连接于载体pGBKT7，然后转化DH5ct感受态细胞，经 菌落PCR、酶切鉴定，确已有重组子。提取重组质粒分别转化AHl09、YI 87 酵母感受态细胞，选择性培养基鉴定结果表明：VP28l有自激活性，不能直接 用于酵母双杂交系统；VP28无自激活性，可用于酵母双杂交系统。 用文库菌株和含VP28融合质粒的菌株做酵母融合，经TDO、QDO缺陷 酵母职杂交系统用于对虾白斑综合症病毒(WSSV)受体基闲的筛选型培养基筛选，最后得到6株阳性克隆。阳性克隆测序得到T3．T5两个cDNA 酵母职杂交系统用于对虾白斑综合症病毒(WSSV)受体基闲的筛选 型培养基筛选，最后得到6株阳性克隆。阳性克隆测序得到T3．T5两个cDNA 片段，大小分别为105 bp、360 bp。分机结果表明：这两个片段在GeneBank 中无相似序列，应该是新的基因片段，这为进一步找到完整的cDNA序列奠定 了基础。 关键词： WSSV；受体基因；中国明对虾；鳃细胞；全长eDNA文库；酵母 双杂交；VP28；VP281 酵母双杂交系统用于对虾白斑综台症病毒(WSSV)受体基园的筛选Screening 酵母双杂交系统用于对虾白斑综台症病毒(WSSV)受体基园的筛选 Screening of the Receptor Gene of WSSV using Yeast Two-Hybrid Systems Abstract White spot syndrome virus is major pathogen of shrimp fanning，and hamper the shrimp aquaculture industry severely．The binding of Virus and receptor is the first step for entry of virus．so，Understanding the infection mechanism and finding the gene of receptor is very important for the treatment ofviral disease．The study of screening gene ofreceptor was peforming in this experiment． In this research the author constructed full—length eDNA library using total RNA from gill of Fenneropenaeus chinensis by homologous recombination．TotaJ RNA was isolated by the NucleoSpin@RNA 11 Kit．The first—strand eDNA was synthesized by using MM