酵母双杂交技术筛选与NS3TP2蛋白结合的肝细胞蛋白编码基因-内科学(消化)专业论文.docxVIP

郑州人学2007屙坝I‘学位论文 郑州人学2007屙坝I‘学位论文 酵母双杂交技术筛选’，NS3TP2芏li山结含的盯细胞ili[J编码是冈 应用酵母双杂交系统3，将多聚酶链反应(PCR)法扩增的NS3TP2基因连接入酵母 表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒，转化单倍体酵母细胞AHl09并在其内表达，提取酵母 蛋白质，进行十二烷基磺钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS—PAGE)和Western免疫印迹分 析然后与转化了人肝细胞文库质粒pACT2的单倍体酵母细胞Y187进行配合，在涂有x—a 一半乳糖(x—a—gal)的营养缺陷型培养基(SD／一Trp—Leu—His—Ade)上进行双重筛选生 长，提取阳性酵母克隆的质粒，转化大肠杆菌提取质粒DNA，然后将此阳性文库质粒与 诱饵质粒进行回交实验进一步筛选后测序，测序结果在GenBank中进行生物信息学分 析。 三、结果： 成功构建NS3TP2蛋白基因酵母表达载体，Western免疫印迹显示了NS3TP2蛋白在 酵母细胞中表达。表达产物在胞内存在，分子量68 000 kd左右。经过回交实验后筛选 出与NS3TP2结合的蛋白基因6种，其中包括空泡蛋白13同系物A(VSPl3A)、脂酰辅 酶A合成酶长链家族成员5(ACSL5)、线粒体基因、脂酰辅酶A结合蛋白(r一氨基丁酸 受体调节因子，苯甲二氮卓结合抑制因子)、真核翻译延伸因子alpha 1、环指蛋白130。 四、结论： 1．成功构建了pGBKT7一NS3TP2酵母表达质粒。 2．首次在酵母细胞中成功表达了pGBKT7一NS3TP2融合蛋白。 3．利用酵母双杂交技术成功筛选出了在肝细胞中与HCVNS3TP2蛋白相互作用的蛋 白质基因。一类是与蛋白质代谢相关的基因：空泡蛋白13同系物A、环指蛋白130、 真核翻译延伸因子alpha 1。一类是与脂肪代谢相关的基因：脂酰辅酶A合成酶长链 家族成员5(ACSL5)和脂酰辅酶A结合蛋白(ACBP)。 4．NS3TP2作为HCV NS3反式激活的蛋白质在肝细胞的蛋白质代谢及脂肪代谢中 扮演了一定的角色，尤其是在脂类代谢中，它可能介导了NS3对HCV感染的肝细胞脂 类代谢的影响，在HCV感染患者脂肪肝的发生上起了一定的作用，为NS3TP2的生物学 功能及HCV NS3致病机制的研究提供了新的线索。 关键词：NS3TP2；酵母双杂交；表达：脂肪代谢：蛋白质代谢 U 郑州人学2007届坝卜学位论j[ 郑州人学2007届坝卜学位论j[ 酵母双杂交技术筛选’，NS3TP2芏li口结台的盯细胞芏Ii亡J编码草闪 Screening of proteins binding gene2 tranactivated by hepatitis C virus NS3 protein from liver cDNA library by yeast two-hybrid technique Postgraduate Hanli Tutor Zhang lianfeng Department ofGastroenterolgy, The first affiliated hospital of zhengzhou university Zhengzhou，Henan 450052 Abstract Background and objective： Hepatitis C virus(HCV)，a member of the Flavivifidae family of viruses，is a major cause of chronic hepatitis and hepatocellular carcinoma．Up to date，HCV infocts an estimated 170 million persons worldwide，but there is no effective way to cure these diseases，only interferon and ribavirin are used on to these related diseases and the curative effect is limited．The research on the mechanism of HCV is improtent to virus hepatitis treatment．Its RNA genome codes for a polyprotein，which is cleaved by viral and cellular proteases to produce at least 10 mature viral protein products，including Core、E