酵母双杂交系统的建立及NGAL相互作用蛋白的筛选与初步鉴定-病理专业论文.docxVIP

汕头大学医学院硕 汕头大学医学院硕士研究生论文 万方数据 万方数据 英文缩略词表 缩略语 英文全名 中文译名 S second 秒 h hour 小时 RT room temperature 室温 AD GAL4 activation domain GAL4 激活域 BD bingding domain 结合域 OD Optical Density 光密度 DO dropout supplement 省却培养基 bp base pair 碱基对 kb kilobase pairs 千碱基对 EB Ethidium Bromide 溴化乙锭 kD kilodalton 千道尔顿 LB Luria-Bertanimedium Luria-Bertani 培养基 MCS Mutiple clone site 多克隆位点 UAS Upstream Activating Sequence 上游激活序列 r/m rotate per minute 每分钟转数 BSA Bovine Serum Albumin 牛血清白蛋白 min minute 分钟 PEG polyethylene glycol 聚乙二醇 NCBI National Center for Biotechnology Inforfmation 美国生物技术中心 DMSO dimethyl sulfoxide 二甲基亚砜 BLAST Basic local alignment search tool 基本同源序列比对工具 X-gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactopyranoside 5-溴 4-氯 3-吲哚-b-D 半乳糖苷 Amp Ampicillin 氨苄青霉素 Kan Kanamycin 卡那霉素 LacZ+ Expresses the lacZ report gene β半乳糖苷酶报告基因 3 缩略语 英文全名 中文译名 Ade– or Leu– Requires adenine(Ade), or leucine (Leu) 腺嘌呤或亮氨酸缺陷 His– or Trp– histidine (His),or trytophan(Trp) 组氨酸或色氨酸缺陷 YPD peptone、yeast extract and dextrose blendmedium 完全培养基 YPDA YPD medium supplemented with adenine 含有腺嘌呤的完全培养基 (0. 003% final concentration) TDO Triple dropout medium 组氨酸, 亮氨酸,色氨酸 SD/–His/–Leu/–Trp 缺陷培养基 QDO Quadruple dropout medium 腺嘌呤,组氨酸, 亮氨酸, SD/–Ade/–His/–Leu/–Trp 色氨酸缺陷培养基 IPTG isopropylthio-β-D-galactoside 异丙基硫代-β-D-半乳糖苷 4 摘 要 NGAL（neutrophil gelatinase-associated lipocalin）基因是 lipocalin 家族中的 新成员。以往我们课题组曾研究发现 NGAL 基因在人食管上皮细胞癌变中显著 过表达，可能具有促进癌细胞侵袭功能，同时还可能与癌细胞的不良分化相关， 提示可能是人类的一种新癌基因，但生化作用机制不明。为此，本研究首先建立 了酵母双杂交技术，然后利用该技术从相关 cDNA 文库中筛选了 NGAL 相互作 用蛋白，并对部分候选者给予了初步鉴定分析，以期为阐明在食管癌等肿瘤中 NGAL 的生化作用机制开辟新途径。 主要研究内容和方法： 一、以大 T 抗原和 p53 蛋白的相互作用为阳性对照，建立酵母双杂交系统，并 就酵母转化实验中如何提高转化效率、酵母菌株培养条件的掌握、变异、 保存问题进行了研究。比较了酵母化学转化中共转化、顺序转化和交配三 种方法的优劣，为下一步进行人类骨髓文库的筛选做准备。 二、运用丹麦学者 Jack Cowland Ph.D 馈赠的质粒 pGEX-NGAL,进行聚合酶链反 应(PCR)，获得 NGALcDNA 全长，并定向插入 DNA-BD 载体 pGBKT7，用限制 性内切酶酶切与 DNA 测序的方法鉴定。 三、运用化学转化法将 pGBKT7-NGAL 转入酵母菌株，观察 NGAL 蛋白对酵母菌株 AH1109 有无毒性，并用β-gal 检测 NGAL 对菌株的报告基因有无自发激活， 用酵母交配的方法筛选预转化人类骨髓文库，通过营养缺陷培养和β-gal 检测初步筛选与 NGAL 蛋白相互作用的阳性克隆。 四、通过酵母质粒抽提法从