酵母双杂交系统检测SK2通道和RyR2的相互作用-神经生物学专业论文.docxVIP

中文摘要 酵母双杂交系统检测 SK2通道与 RyR2的相互作用 研究生袁建党 导师章酋 许继用 郑州大学基础医学院 阿南郑州 450052 摘要 研究背景和目的: +小电导 Ca2 + 激活 K 通道 (Small-conductance calciumactivated potωsium channal) 有四种不同的亚型，分别是 SKl.. SK2， SK3 和 SK4 通道。其中 SK2 主要存在于中枢神经系统，例如海马 CAl 锥体细胞，外周组织也有表达，例如 +人和小鼠的心肌、平滑肌组织。 SK2是唯布通过细胞内 Ca2 + 激活的 C 通道， +其钙源主要来自 L型 Ca2 + 通塌，部分来自肌浆网叩anodine rec叩tors (RyRs) 的 +Ca2 + 释放通道。研究证明， SK2对蜡毒明肤 (apamin) 比较敏感，它参与了动 作电位的后复极化 (after hyperpolarization ，AHP) 的形成，对调节突触后电位 的形成长时程增强 (long.翩term potentiation ，LTP) 的阙值以及突触的可塑性有建 要意义，对于中枢神经系统的学习和记忆方剧也起到一定的作用。 受体 RyRs 是存在于真核生物细胞肌浆网 (Sarcoplasm icreticJllum，SR)上的一 +种细胞内 Ca2 + 释放通道，现在哺乳类动物的组织中巳鉴定出 RyR 的 3 种亚型， 分别是 RyRl (ryanodine rec叩tor type 1) ，RyR2( ryanodine rec叩tor type 2)和 +民yR3( 叩anodine rec叩tor type 匀。 RyR2 主要存在于心肌细胞，位于细胞的肌浆 + +网上。 RyR 是细胞内 Ca2 + 释放的遇道，通过将放 SR 内的 Ca2 来调节细胞内的 中文摘要 Ca2+ 浓度。主要作用机制是钙离子诱导的钙离子释放( Ca2+ induced Ca2+ release， CICR) ，为骨髓肌和心肌收缩提供肌质网 Ca2+。直接参与心肌的兴奋收缩棋联 +过程， RyR2 的激活可使细胞内钙离子迅速增加，其 Ca2 + 浓度可快速增高 10 倍 以上。 上地提示， RyR2的激活可使大量的 Ca2+ 从肌浆网释放出来即 Ca2+ 诱导 Ca如 +释放 CICR) ，而SK2又是 Ca2+ 依赖型的例通道，其激活依赖细胞内 Ca2 浓度 + 的增高，另 SK2和 RyR2功能异常均可引随心肌功能的变化，如心率失常等。 由此推测， SK2和 Ry盯在心肌中可能存在着…定的功能联系。本实验宽的研究 已表明心肌 SK2酒道与 RyR2可形成免疫复合物，但是否存在直接相互作用， 尚不明了。故本研究采用醉母双杂交的方法进…步检测两者之间是否存在分子 相互作用的位点。对于深入研究两蛋白的结构和功能的相关性将有积极作用， 并为揭示两者与心脏功能的关系探索一条新的途径。 方法: L 目的基因扩增:构建 SK2和 Ry阳的 cDNA 文库，根据文库质粒基因序 列和载体质粒特点设计并合成引物。 PCR 扩增 SK2和民yR2目的基因片段，琼 脂糖凝胶鉴定并凹收。 2. SK2-T 和 RyR2翩T 克隆构建: SK2的目的基因与 T 载体连接，选择培养 基培养， PCR 鉴定，提取 SK2-T 震组质粒。经双酶切 SK2-T 重组质粒，琼脂糖 凝胶鉴定，回收目的基因片段，测序鉴定。重组 RyR2-T 质粒构建同 SK2-To 3. pGBKT7 SK2和 pGADT节7-巩 目的基因捅入双酶切纯化的 pGBKT7 载体质粒，构建重组 pGBKT7-S K2质粒。 选择培养基培养， PCR 鉴定，提取 pGBKT7-S K2重组质粒，双酶切 pGBKT7-S K2 囊组质粒，琼脂糖凝胶鉴定，回收目的基因片段、测序鉴定。囊组 pGADT7-Ry R2 质粒构建问 pGBKT7-S K2o 4. 转化酵母菌: pGBKT7-S K2、 pGADT7-Ry R2电转化酵母商。醉母菌 AHI09 用YPDA 培养基 30C恒温培养。用电转化方法将 pGBKT机SK2和 pGADT7-Ry R2 11 l-l· l -l· 重组质粒分别转化酵母菌 AHI09 ，营养缺陷培养基培养，用双营养缺陷培养基 做自身激活检测:将 pGBKT7-S K2的 3 个重组质粒分别与 pGADT7-RyR2的 16 个重组质粒两两配对，共转化酵母菌 AHI09 。根据酵母菌有无生长和蓝白显色 鉴定双杂交结果。 结果: 1. PCR 扩增 3 个 SK2目的基因片段和 16 个 RyR2目的基因片段，凝胶电泳可 见相应大