绞股蓝核糖体失活蛋白的分离、克隆与表达-农药学专业论文.docxVIP

福建教韩大学博士学位论文摘要 福建教韩大学博士学位论文 摘要 核糖体失活蛋1自(ribosome．inactivating proteins，PIP)具有抗肿瘤和抗病毒 等医用价值，以及抗植物病毒和瘸原真菌等农用价值。它是一种多活性的物 质，不同RIP具有各自独特的功能，其潜在活性还在不断发现之中。葫芦科 (Cucurbitaceae)植物大多药食同源，其中蕴涵着极其多样的RIP，但多数己知 的RIP其基因尚未被克隆，而目前仍无一套快速筛选RIP新基因的方法。葫芦 科中的绞股蓝(Gynostemmapentaphyllum)具有抗癌和抗衰老等特殊功效，其中 的皂甙和黄酮成分的研究已有大量报道，但其活性蛋白成分未见报道。为此， 本研究开展绞股蓝RIP的分离纯化、基因克隆、原核表达以及转基因植物研究。 率先对绞股蓝活性蛋白成分进行研究，从中分离到一种新的核糖体失活 蛋白(绞股蓝毒蛋白，Gynostemmin)。它具有很高的抗TMV活性。其分子 量约为27 kDa。测得其N．端19个氮基酸序列：DINFSLAGADGQTYNTFIA， 与其它植物RIP的同源性为10％--73％，与葫芦科RIP的同源性为37％-73％。 根据葫芦科RIP上、下游两段高度保守的氨基酸序列设计简并引物对 L，Yl／LY2，对基因组DNA进行PCR扩增，首次建立了RIP新基因快速筛选 体系。从冬瓜和南瓜中分别获得了1个和5个RIP新基因，长度为408 bp， 编码136舱，与其它葫芦科RIP对应区段的同源性约为35％一85％。 比较发现，19个葫芦科RIP的LYl／Ly2区段上完全相同的氨基酸有29个。 其中7个在其它科属来源的luP中也完全保守，包括构成活性中心的3个残基 E160、R163和w192。根据LYI／LY2区段同源性构建的系统进化树表明，葫芦科 KIP之间的进化关系与其来源植物阃的亲源关系大体一致。 通过DNA片段克隆、RACE扩增、cDNA克隆和DNA克隆，从绞股蓝中分 离了13个RIP基因，其中lO个为cDNA序列，3个是DNA序歹lj(GP609、DNA．750 和DNA-8001)。它们之间在碱基水平和氨基酸水平上的同源性都很高，可根 据序列上发生缺失的有无及其类型将其分为4组；组l，发生6 bp缺失(535 GAAAAC 540，与574~579间的序列完全一样)，包括Gynostemminll、GP609 和CX8405A，编码275 aa：组2，缺失87 bp(122~208)，包括DNA-750和CX820。 编码248蹰：组3，包括5RACE和DNA-8001，不发生组2的87 bp缺失，但因其 序列较短，无法确认是否具备组1的6 bp缺失；组4，包括Gynostemminl、111、 福建农林大学博士学位论文 福建农林大学博士学位论文 lI Iv、v以及EMUZW和RHXJB，既无87 bp缺失也不发生6 bp缺失，编码277 an。 其中GP609与其它葫芦科RIP的LYI／LY2区段的同源性，碱基水平为47％--61％， 氨基酸水平为37％49％。5RACE中包含了由23 aa组成的信号肽 “MR、狐RFCTVVAILLYFGFHLAEC”，同时包含有5’UTR序列，其中含有kozak 序列“AAAAAA”。 对绞股蓝RIP基因家族及其编码氨基酸进行的比较分析发现，绞股蓝RIP 前体成熟过程中可能发生C．末端切除，并因此造成等电点从弱酸性跃迁至强 碱性，这种现象以前未见报道。分析结果进一步支持了RIP基因无内含子的观 点。5个含有3’UTR的成员中，Gynostemminl比另外4个多了两个小的茎环结 构和一富含AU的不稳定子元件ARE(AU-rich element)，其mRNA的稳定性可能 因此受到影响。运用生物信息学软件对绞股蓝luP前体进行碱基组成和密码子 偏倚性、氨基酸组成特征、功能位点、亚细胞定位、跨膜结构、核酸结合基 序以及空间结构等方面的分析。 分别将GP609和RHXJB转)xpGEX．2T融合表达载体，在大肠杆菌DH5 a 菌株中实现融合表达。将DNA．8001连接至gpET--5a表达载体上，在大肠杆菌 BL21(DE3)菌株中实现天然表达，表达产物对n州的抑制效果很差，其原 因可能是C一末端延伸序列的存在抑制了抗TMV活性的发挥。 分别构建了含有GP609和EMUZW的pEmu．mcs-N植物表达载体，同时构 建了含有