胶质细胞源性神经营养因子受体alpha1结构与功能关系的探讨-病理生理学专业论文.docxVIP

中文摘要1．GFRal基因的克隆、表达及活性蛋白的获得 中文摘要 1．GFRal基因的克隆、表达及活性蛋白的获得 从新生4d SD大鼠海马组织中提取总RNA，通过RT—PCR，扩增出GFRal eDNA。将GFRal eDNA克隆至合T7启动子的质粒pET-28a(+)中，构建表 达质粒pET-GFRaI，转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得表达菌株BLGFRaI。表 达菌拣经IPTG诱导后，SDS检测GFRal蛋白表达，并形成包涵体。用 Ni2十一NTA树脂纯化并在Ni”一柱上复性后，纯度达90％以上。 2．GDNF的表达及其对PCI2基因工程细胞的影响 将表达质粒pET-GDNF转化大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导后在 Ni2+-NTA柱上进行纯化，稀释复性后，纯度达90％以上。利用细胞转染技术， 把pcDNA3．0-GFRal、pcDNA3．0-RET及pcDNA3．0-GFRal+pcDNA3．0一 RET质粒分别转染入PCI2细胞，G418筛选稳定克隆，构建PCI2工程细胞株。 用GDNF分别刺激工程细胞，3天后观察其存活和分化情况。纯化和复性后的 重组GDNF蛋白，可显著增强PCI2一GFRaI—RET工程细胞的存活和分化；对 PCI2一RET工程细胞没有任何作用；对PCI2一GFRal的存活和分化作用显著强 于对PCI2一RET的作用，但也显著低于对PCI2一GFR口卜RET细胞的作用。初 步明确GDNF对PCI2细胞的营养作用必须经GFRal介导井有RET参与。 3．GDNF家族及其受体GFRas家族的进化踪迹 用进化踪迹分析方法，对GDNF家族及其受体GFR家族进行进化分析； 利用ClustalX-V1．81构建该家族的多重序列联配和进化树；利用PHD预测 GFRas的二级结构及其残基的溶剂可及性，从而绘出了GFRas二级结构模式 图，并进一步确定突变区域和突变位点。 4．GFRal结构与功能分析 利用PCR和DNA重组技术，在GFRas二级结构预测的基础上，对GFRal 分别进行了N一端、c_端、C_端螺旋和中央区的缺失突变。在大肠杆菌中分别表 达这四个突变体。利用PCI2细胞的存活和分化情况，分别观察这四个突变体 对介导GDNF神经营养作用的影响。结果发现GFRal N一端对介导GDNF的 营养作用不重要；C-端靠近中央区的螺旋对介导GDNF的营养作用则是必需 的；中央区对介导GDNF的神经营养作用非常重要。 关键词胶质细胞源性神经营养因子；胶质细胞源性神经营养因子受体 Ⅱ1；RET酪氨酸激酶；PCI2细胞；结构与功能 研究生：陈雪红(病理生理学) 导师：崔瑞耀 英文摘要RESERCH 英文摘要 RESERCH ON THE STRUCTURE～FUNCTION OF GLIAL CELL—LINE—DERIVED NEUROTRO— PHIC FACTOR RECEPTOR ALPHA ABSTRACT morphogenetic injuries．The GPhn- 英文摘要 英文摘要 purified recombinant GFRal obtained．Based the evolutionary method，muhiple alignment dendrogram then carried by the ClustalX program and constructed from multiple alignment for family．Secondary residues relative solvent accessibit_ itv口redicti。ns carried PHD prediction program．The residues targeted for site-directed mutagenesis the central domain C-terminal segments adjacent the domain of GFRal埘th relatively high solvent aeeessibiHty． The msin results follows： 1．Expression and purification of recomfiinant GFRal obtain recombinant GFRal and Study biological activity，the eDNA encoding tbe mature GFRul was isolated RT-PCR with total RNA extracted from hippocampus tissue．The plasmid pET-GFRal WaS constructed b