胶质类芽孢杆菌3016全基因组测序及菌种水平特异分子标识的筛选和鉴定-微生物学专业论文.docxVIP

山东农业大学硕士学位论文 山东农业大学硕士学位论文 胶质类芽孢杆菌 胶质类芽孢杆菌 3016 全基因组测序及菌种水平特异分子标识的筛选和鉴定 PAGE PAGE 1 PAGE PAGE 2 中文摘要 胶质类芽孢杆菌（Paenibacillus mucilaginosus）是微生物肥料广泛应用的功能菌种 之一，菌体自身通过代谢产生有机酸、氨基酸、多糖、激素等物质促进植物的生长， 并且能够分解含钾矿物，释放出钾及其他营养元素，有些菌株还具备溶磷和固氮功 能。胶质类芽孢杆菌在农业生产中表现出提高土壤速效钾与速效磷含量、促进作物生 长、提高作物产量和品质等多方面的效应，一直是微生物肥料研发的重点和热点之 一。 本论文以实验室分离得到 14 株胶质类芽孢杆菌为实验材料，进行了形态学观察、 生理生化测定、16SrDNA 和 gyr B 基因测序、系统发育分析。通过溶磷、解钾、固氮 等生物学功能的测定比较，从中筛选得到了一株高效多功能优良菌株，编号为 P. mucilaginosus 3016。该菌株的溶磷、解钾效果分别比对照增加至 187.8%和 131.4%，固 氮酶活性为 3.51nmol（C2H4）/h·mg（蛋白），发酵液中产生的苹果酸和乙酸分别比对 照增加 89.9%和 277.7%，同时产生少量柠檬酸（3.74mg/L）、生长素（0.03mg/L）和 赤霉素（1.01mg/L），对植株具有一定的促生能力。 采用 Sanger 测序方法与 454 高通量测序相结合的方法，对 P. mucilaginosus 3016 菌 株全基因组序列进行测序，利用 SOAP de novo v1.04、454 Newbler v2.3 软件进行序列 的拼接，获得全基因组序列精细图谱。通过基因组序列拼接、空缺填补和低质量序列 校验等工作后，绘制了 3016 菌株全基因组序列图谱，并应用生物信息学方法对基因组 进行了注释。 利用比较基因组学分析手段，根据 3016 菌株全基因组序列，选择胶质类芽孢杆菌 特异性片段为靶基因，设计特异性引物。通过 PCR 条件的优化和特异性、灵敏度的验 证，筛选得到一对胶质类芽孢杆菌的特异引物（orf06701-F：5-ATGGAGGAAACATG GGGTGA-3/orf06701-R：5-TCAGGAATGAAGGCCCCCTT-3），建立了胶质类芽孢 杆菌快速鉴别方法。研究表明，该引物仅能在以胶质类芽孢杆菌为模板时特异性扩增 333bp 保守序列，其检出灵敏限度为每微升反应体系 400-1000 个细胞，以实验选取的 其他参比菌株为模板时并不能扩出该序列，该引物具有良好的特异性；同时，用该方 法成功地鉴定了从土壤中分离得到的胶质类芽孢杆菌，并且得到的特异性片段序列同 源性达到 100%。 本文对一株 P. mucilaginosus 3016 进行全基因组测序，该菌株是一株具有溶磷、解 钾、固氮等多项生物学功能，微生物肥料重要功能菌之一。同时，筛选并鉴定了一对 特异引物，建立了一套快速鉴别胶质类芽孢杆菌的方法，为微生物肥料中胶质类芽孢 杆菌的检测及生态评价提供技术支撑。 关键词：微生物肥料；胶质类芽孢杆菌；全基因组序列；特异引物；快速鉴别 Genome sequencing of Paenibacillus mucilaginosus 3016 and scree -ning/identification of special molecular marker at species level Abstract Paenibacillus mucilaginosus is consequently widely used as microbial fertilizer in agriculture. P. mucilaginosus is a multi-function bacteria, such as phosphorus-solubilizing, potassium-releasing, nitrogen-fixing and phytohomone-producing etc. So it has been the focus and hot spot in the field of microbial fertilizers. In this paper, 14 strains of P. mucilaginosus were selected and identified using morphological, physiological and biochemical characteristics, 16S rDNA and gyr B gene sequence. A st