降低乙醇和乙酰CoA生物合成对酿酒酵母异丁醇产率的影响-生物化工专业论文.docxVIP

万方数据 万方数据 Dissertation Submitted to Hebei University of Technology for The Master Degree of Biochemical Engineering EFFECTS OF ELIMINATING ETHANOL AND ACETYL-CoA BIOSYNTHESIS ON ISOBUTANOL YIELD OF Saccharomyces cerevisiae By Li Yang Supervisor: Associate Prof. Hu Bin Associate Prof. Zhang AiLi March 2015 This work supported by the National Natural Science Foundation of China, No. Doctoral Fund of Ministry of Education New Teacher category, No. 20121317120014, Natural Science Foundation of Hebei Province, No. B2013202288, Higher Education Department of Hebei Province Science and Technology Research Project, No. q2012024, Outstanding Young Hebei University of Science and Technology Innovation Fund Project, No. 2012009. 摘 要 异丁醇作为一种新型的生物燃料，已经受到学术界和工业界人士的关注。异丁醇 比乙醇有更高的辛烷值和能量密度。另外，异丁醇与汽油具有相似的吸收性、能量密 度和辛烷值，可在现有的基础设施中使用。目前，多数微生物对醇类有较低的耐受性， 异丁醇的产率很难大幅度提高。但是，酿酒酵母发酵合成乙醇已经工业化生产，对醇 类有很高的耐受性，并且，酿酒酵母在酸性环境下具有稳定性和耐受性。酿酒酵母作 为细胞工厂的研究平台，基因测序已经完成，拥有比较成熟的 DNA 重组技术。因此， 可以通过 DNA 重组技术改进酿酒酵母生产异丁醇的能力。 本研究以实验室保藏的酿酒酵母 W303-1A 为出发菌，通过 DNA 重组技术，构建 酿酒酵母合成异丁醇的研究平台，提高酿酒酵母发酵异丁醇的产率。根据酿酒酵母生 物合成异丁醇的代谢途径和前体丙酮酸代谢去向分析，分别通过以下四种途径来研 究：第一，利用两步基因置换法过量表达编码分枝氨基酸转氨酶 BAT2，提高异丁醇 合成通量。第二，利用一步基因置换法缺失编码内源性的丙酮酸脱羧酶 PDC6，减少 乙醇的生物合成。第三，利用一步基因置换法缺失编码二氢硫辛酸脱氢酶 LPD1，减 少丙酮酸合成乙酰 CoA。第四，利用构建的表达质粒 YEplac181-PGK1p-ILV2 和 YEplac195-ILV3p-PGK1p-ILV3，过量表达编码乙酰乳酸合酶的 ILV2 和 2-羟异戊酸脱 水酶 ILV3，提高缬氨酸代谢通量。其中，突变株 HZAL-2(PGK1p-BAT2)中过量表达了 BAT2；突变株 HZAL-7(PGK1p-BAT2 pdc6::R)中过量表达了 BAT2，缺失了 PDC6；突 变株 HZAL-12(PGK1p-BAT2 lpd1::RYUR)中过量表达了 BAT2，缺失了 LPD1；突变株 HZAL-11(PGK1p-BAT2 lpd1::RYUR pdc6::R)中过量表达了 BAT2，缺失了 LPD1 和 PDC6。 经过基因修饰后的酿酒酵母菌进行厌氧发酵试验。突变株 HZAL-7(PGK1p-BAT2 pdc6::R)[YEplac181-PGK1p-ILV2/YEplac195-ILV3p-PGK1p-ILV3]，相对于对照菌株异 丁 醇 的 产 率 提 高 11.4 倍 。 而 突 变 株 HZAL-12(PGK1p-BAT2 lpd1::RYUR)[YEplac181-PGK1p-ILV2]相对于对照菌株异丁醇的产率提高 8.8 倍；缺失 PDC6 基 因 的 突 变 株 HZAL-11(PGK1p-BAT2 lpd1::RYUR pdc6::R)[YEplac181-PGK1p-ILV2]相对于对照菌株异丁醇产率提高 13.6 倍。 结果表明：通过 DNA 重组技术修饰特定基因减少乙醇和乙酰 CoA 生物合成，提 高酿酒酵母合成异丁醇的产率具有一定的可行性，对了解异丁醇的生物合成的分子机