金荞麦的提取分离及其抗HBV活性研究-生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

汕头大学硕士学位论文 汕头大学硕士学位论文 I I 摘 要 本论文选取了具有防治肝炎或清热解毒作用的 33 种中草药，用重组的含有乙型肝炎 病毒（Hepatitis B virus，HBV）基因组的人肝癌细胞 HepG2 2.2.15 为体外筛选模型，以药 物对 HepG2 2.2.15 细胞合成、分泌 HBeAg 和 HBsAg 抗原的抑制作用作为筛选指标，进行 了抗 HBV 活性初筛。结果发现所选取的 33 种中草药中有 7 种存在抗 HBV 活性，其中金 荞麦的活性最强。选定金荞麦为进一步的研究对象，筛选抗 HBV 作用的活性部位，为从 金荞麦中分离出抗 HBV 有效成分或单体化合物的研究与开发奠定基础，具体研究内容如 下： 1）金荞麦、石花、骆驼刺、槟榔等 33 种中草药粉碎，60%乙醇热回流提取，减压回 收溶剂，得到 60%乙醇浸膏。 2）HepG2 2.2.15 细胞分泌 HBeAg 和 HBsAg 规律的监测，结果显示，HepG2 2.2.15 细 胞 HBsAg 和 HBeAg 的分泌量在第 8 天达到最高值。 3）以 HepG2 2.2.15 细胞为模型对金荞麦、石花等 33 种中草药进行体外抗 HBV 活性 初步筛选。结果显示，金荞麦、石花、佛甲草、石榴皮、骆驼刺、溪黄草、槟榔 7 种中草 药的 60%乙醇提取物具有较好的体外抗 HBV 活性。 4）选取活性较显著的金荞麦、石花、佛甲草、石榴皮及槟榔为实验对象， 在相同浓 度梯度（10、20、40μg/mL）下比较这五种中草药对 HepG2 2.2.15 细胞分泌 HBsAg、HBeAg 的影响。结果显示，金荞麦对 HepG2 2.2.15 细胞分泌 HBsAg、HBeAg 的抑制作用明显高 于槟榔、石榴皮、石花、佛甲草，其抑制率均达到 50%以上。 5）将金荞麦 60%乙醇总提取物 A 的水溶液，经 AB-8 型大孔吸附树脂吸附、洗脱等 分离手段，最终得到 B、C、D、E 4 个部位。对分离的 B、C、D、E 部位进行体外抗 HBV 活性筛选，结果表明，D 部位能够显著抑制 HepG2 2.2.15 细胞分泌 HBsAg 和 HBeAg，在 最大无毒的给药浓度 40μg/mL 下，对 HBsAg 和 HBeAg 的抑制率分别为 54.8%和 53.1%。 6）确定有效部位 D 后，经硅胶柱层析分离、氯仿-甲醇洗脱得 8 个部位：D1、D2、 D3、D4、D5、D6、D7 和甲醇部位，经体外活性检测发现 D7 有较好的抗 HBV 作用，无 毒浓度下，D7 对 HBsAg 和 HBeAg 的抑制率分别是 52.7%和 59.7%。 7）利用反相液相色谱 C18 柱对 D7 部位进行分离，得两个组分 F、G。:体外活性检测 结果表明，在最大无毒浓度下，G 对 HBsAg 和 HBeAg 的抑制率分别为 52.6%和 72.3%； II II 阳性对照物苦参素注射液对 HBsAg、HBeAg 抑制率分别为 20.8%和 48.5%，G 对 2.2.15 细 胞 HBsAg、HBeAg 的分泌抑制作用强于阳性药物，两者具有显著性差异。 本文经过对 33 种中草药抗 HBV 活性的筛选，发现金荞麦提取物具有很强的抗 HBV 活性，经硅胶柱层析和 HPLC 分离纯化后，与粗提物相比对 HBeAg 的抑制率提高约 20%， 说明分离纯化后金荞麦抗 HBV 活性部位得到富集；活性实验显示金荞麦提取物对 HBsAg 和 HBeAg 的抑制率随浓度的增加呈上升趋势，说明金荞麦中含有抗 HBV 活性的有效成分， 具有开发成抗 HBV 药物的潜力。 关键词：金荞麦；抗 HBV 活性成分；分离；筛选；HepG2 2.2.15 细胞；HBeAg 和 HBsAg PAGE PAGE III Abstract Thirty-three kinds of Chinese herbal medicine were selected for screening anti-HBV drug in vitro. In the experiments, the HepG2 2.2.15 cell model was employed and the inhibition effects on synthesis and secretion of HBeAg and HBsAg were used as the activity-evaluating marker. As a result, seven kinds of Chinese herbal medicine were found to have anti-HBV activity. Among them, Fagopyrum