课件：实验七、兔肾原代细胞的分离与培养.ppt

兔肾原代细胞的分离与培养 岳续朋 2013-12-27 如何获得体外培养的细胞 肺癌A549 结肠癌colo320 人肾上皮细胞293T 肝癌HepG2 原代培养 是从供体取得细胞、组织或器官后在体外进行首次培养直至成功地进行首次传代之前的培养。因此，较为严格地说是指成功传代之前的培养，此时的细胞保持原有细胞的基本性质，如果是正常细胞，仍然保留二倍体数。但实际上，通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞。 材料与方法 实验动物 出生3天的家兔（SPF级），雌雄不限 仪 器 超净工作台、恒温培养箱、倒置显微镜、水浴槽、离心机、酒精灯、解剖剪、眼科剪、镊子（尖头、平头和有钩镊）、不锈钢滤网（100目、200目）烧杯、培养皿、培养瓶、离心管、吸管。 试剂 75%乙醇 PBS缓冲液（pH7.2） D-HanKs液（无钙镁离子） 消化液（0.5%胰蛋白酶、0.02%EDTA1:1混合） 0.4%台酚蓝 RPMI-1640培养基(酚红指示剂) 原代培养方法流程图 组织块培养法 消化培养法 处死 取材 接种 培养 剪切清洗 消化 计数 培养 处死 取材 剪切清洗 组织块培养法 动物处死 取新生的家兔（出生2-3天）一只，用颈椎脱臼将其处死，浸入盛有75%乙醇的烧杯中5-10秒钟，然后取出放在解剖平皿中送入超净工作台。 取材 用碘酒和75%的乙醇再次消毒一次，打开消毒器械包，用镊子扯开腹部皮肤，用解剖剪剪开腹腔，暴露腹腔脏器，用另一个镊子夹起肠管翻向一侧，暴露出位于腹腔背侧脊柱两侧的肾脏（左高右低），将其取下，放于消毒的培养皿中。 组织块培养法 剪切 剪开肾膜，剥向肾门，去除肾膜，用吸管吸取灭菌PBS（HnaKs液）将肾脏清洗3次，去除血污；将肾脏移入另一平皿中，将肾沿纵轴切开，减去肾盂，用眼科剪将肾组织反复剪切，直至0.5-1mm3组织块。 清洗 剪切后的组织块再用灭菌的PBS（HanKs液）冲洗数次，直到PBS澄清为止。 组织块培养法 接种 用弯头吸管小心吸取组织块，将其均匀分布在培养瓶底部，控制组织块间距在0.5cm左右，每个25ml培养瓶可排布15-20块。轻轻翻转培养瓶，使瓶底向上（注意不要让组织块滑动），加入3-5ml培养基，盖好瓶盖，置于二氧化碳培养箱培养2-3小时。此时组织块略干燥，能够附着于瓶底部。 培养 慢慢翻转培养瓶，使培养基浸泡附着于瓶底的组织块，置培养箱中静置培养。操作过程动作要轻柔。 观察 24小时后取出观察，在显微镜下观察已贴壁的组织块有无细胞长出。 组织块去除 组织块贴壁培养4-7d后，在镜下观察可见大量细胞爬出，用吸管将组织块吹下、去除，继续放置于37℃，5% CO2?培养箱中。 消化培养法 处死动物、取材、剪切以及组织块的清洗都与组织块培养法相同。将组织块移入无菌的离心管中，静置数分钟，使组织块自然沉降到管底，弃上清。 消化及分散组织块 向盛有组织块的离心管中加入含EDTA的0.25%的胰蛋白酶，体积约为组织块体积的5-8倍，与组织块混匀后，置于37℃的水浴槽中消化10-20分钟，其间每隔5分钟摇动一次。当组织块变得疏松、颜色发白时，从水浴槽中取出离心管，加入2-3ml培养基，终止消化，用吸管反复吹打，直到大部分组织块分散成单细胞或细胞团状态为止，1000rpm离心5分钟，弃去上清，再加入新鲜的培养基。将此细胞悬液用100目、200目的不锈钢滤网过滤至烧杯中。 消化培养法 细胞活性检测 取9滴细胞悬液滴入另一清洁试管，加0.4%台酚蓝1滴染色2-3min，镜下观察，以细胞核拒染作为活性良好的细胞。拒染率＞95%。 细胞计数及稀释 对过滤的细胞悬液进行计数，根据计数结果，用培养基稀释，稀释密度以5x105-1x106/ml为宜。 接种培养 将稀释好的细胞悬液分装于培养瓶中，25ml培养瓶分装5ml为宜。瓶上标记时间、细胞名称以及培养基种类，置于37℃的CO2培养箱中培养。 消化培养法 观察 接种培养后要每天观察培养基是否污染，染色变化以及细胞生长状况。培养基呈黄色且浑浊表示已污染，紫红色表示细胞生长不良，桔红色表明细胞生长状态良好。 污染 良好 生长不良 注意事项 无菌操作 培养瓶、吸管在清洗干净之后，装在铝盒和铁筒中，120℃，2小时干烤灭菌备用；手术器材、瓶子瓶塞、配好的缓冲液高压锅121℃，20min灭菌；培养基、血清、消化液等用G6滤芯负压抽滤备用。在无菌操作中，一定要保持工作区的无菌清洁。 组织块清洗 组织块一定要冲洗干净，尽量除去血细胞，避免溶血对培养细胞的生长造成影响。 谢 谢！