一株鸡源嗜铅乳酸菌筛选鉴定.docxVIP

一株鸡源嗜铅乳酸菌筛选鉴定 摘要：试验目的是从肉鸡的肠道内容物及排泄物 中筛选出具有铅抗性的细菌，用于重金属铅的去除。采用涂 布平板技术从采集的样品中共分离筛选到8株具有较好铅抗 性和吸附性的菌株，其中JT1菌株对铅的抗性（800 mg/L） 和去除能力（66.95%）最高。通过培养特征、形态观察、 生理生化鉴定、16SrDNA序列分析等方法证明，所得JT1菌 株为屎肠球菌（Enterococcus faecium）。该菌株可以在10? 45°C、pH 4. 5?9. 6、6. 5%NaCl 溶液、0.8%胆盐、0. 1%胰蛋 白酶浓度条件下生长良好。 关键词：鸡；重金属；铅；乳酸菌 中图分类号：Q939. 92文献标识号：A文章编号： 1001-4942 （2014） 02-0072-06 由于人为因素（农业、工业及军事作业）影响，重金属 对环境的污染越来越严重，近几年已逐步成为全球问题。重 金属是生物体非必需元素，对植物、动物都具有毒性。由于 重金属的非生物降解性和永久存在性，很容易在土壤、植物 以及水生植物和动物中积累，从而导致其浓度在食物链中不 断放大[1] O 在有害重金属中，铅（Pb）和镉（Cd）是最主要的污染 物，可以引起多种生物有机体的功能障碍，通过食物链进入 人体后，可引起各种疾病，例如镉会引起骨软化、肺癌、肾 癌、心血管系统和生殖系统紊乱［2］,铅会损坏中枢神经系 统、降低记忆力、影响儿童的智力发育和骨骼生长［3］。 研究显示，已有利用大肠杆菌、枯草芽砲杆菌、酵母菌 等细菌和真菌清除水体环境中重金属的报道，且效果显著 ［4］。迄今尚未见从环境及动物体内分离筛选具有重金属抗 性乳酸菌的报道。本试验从肉鸡肠道中分离和鉴定出具有铅 抗性的细菌，并对其16S rDNA序列进行了分析，为进一步 将其作为金属清除益生菌添加到动物饲料或食品中奠定基 础。 1材料与方法 1.1材料和仪器 培养基：MRS液体培养基：蛋白豚10 g,乙酸钠5 g, 牛肉膏10 g,酵母膏5 g,磷酸氢二钾2 g,葡萄糖20 g, MgS04 ? 7H20 0. 2 g, MnS04 ? 4H20 0. 25 g,柠檬酸二铁 2 g, 吐温-80 1 ml,蒸馆水 1 000 ml, pH 5. 4?5. 6, 115°C灭菌 30 min； MRS固体培养基：MRS液体培养基中加入1. 4%琼脂; 改良MRS固体培养基：MRS固体培养基中加入5%碳酸钙；LB 肉汤；营养琼脂。 试剂：乙酸铅（AR）；碳酸钙；Tris； EDTA；十二烷基 硫酸钠；NaCl；酚/氯仿/异戊醇：（25：24：1）。 仪器：电热恒温鼓风干燥箱：上海市精宏DHG-9036A； 高压蒸汽灭菌锅：鸟取三洋电机（广州）有限公司；精密 pH计：德国赛多利斯股份公司；水浴恒温振荡器：金城国胜 实验仪器厂；电子分析天平：上海越平科学仪器有限公司； 原子吸收分光光度计；高速冷冻离心机；PCR仪；电泳仪； 凝胶成像设备。 1.2试验方法 1. 2. 1样品的采集于2011年从山东省日照市果庄肉鸡养 殖场及青岛农业大学动物科技学院实验基地无菌采集粪便 样品。菌株筛选试验在青岛农业大学食品风险分析实验室进 行，以MRS固体培养基作为分离培养基。 1.2.2耐性菌株的驯化、筛选称取5. 0 g新鲜样品，在 无菌条件下将其放入装有适量玻璃珠和45 ml无菌生理盐水 的锥形瓶中，37°C、140 r/min振荡30 min后稀释至10-3、 10-4、10-5,各吸取0. lml分别涂布于含有100、200、400、 800 mg/L Pb2+的MRS固体平板上，37°C培养，于24、48 h 时观察平板上细菌的生长状况［5］。将筛选出的耐铅菌株逐 步在含更高铅浓度的培养基上接种培养，从而获得目的菌 株。将获得的优势耐铅菌株在含200 mg/L Pb2+的培养基上 分离纯化，最终获得单一菌株并保存（甘油管保存法）。 1.2.3菌株稳定性的测定将获得的优势菌株在含200 mg/L Pb2+的MRS固体培养基上连续传代多次，观察其对铅 的耐受性是否发生变化，从而判断其稳定性［6］。 2. 4耐性菌株的吸附铅试验将获得的优势菌株离心后 的湿菌体加入10 ml含20 mg/L Pb2+的LB液体培养基中， 振荡吸附后，12 000 r/min离心5 min,取上清液定容至50 ml,测定Pb2+的浓度，重复3次。以加大肠杆菌为对照，以 不加菌为空白对照。 1.2. 8JT1菌株生长特性研究 生长曲线的测定：将活化好的JT1菌株按1%的接种量 接入MRS液体培养基中，371摇床培养，每隔4 h取样一次, 用分光光度计测定菌液的OD600值，用未接种的MRS液体培 养基作为空白对照，以培养时间为横坐标，