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T—DNA插入突变体在植物基因功能研究中应用 摘要：在植物的基因克隆和功能分析研究中，有 许多种策略，其中利用突变体是最常用的方法之一，但天然 的突变体数量很少且难以发现，利用农杆菌介导的T-DNA标 签法得到突变体［1］是目前研究植物功能基因组最有效、使 用最广泛的手段，广泛应用于大规模植物基因功能分析，据 统计有40%的拟南芥突变基因是用T-DNA标签法克隆的。 关键词：T-DNA；突变体；基因克隆和功能分析 根癌农杆菌介导的遗传转化由于操作简单、转化效率 高、插入片段稳定性好、已被广泛应用于植物转基因研究。 具体思路是将外源T—DNA转入植物基因组，以T—DNA作为 插入标记，来分离或克隆因为插入而失活的基因并研究基因 功能。由于T—DNA左右边界及内部的基因结构是已知的， 因此对获得的转基因T-DNA插入突变体就可以通过已知的外 源基因设计引物，利用相应的PCR策略进行突变基因的克隆 和序列分析，对比突变的表型进而研究基因的生理生化功 能。 T-DNA插入突变简介 T-DNA是根癌农杆菌Ti质粒上的一段DNA序列，它能整 合到植物基因组中并稳定地表达。T-DNA在植物中一般都以 低拷贝插入，多为单拷贝。单拷贝T-DNA -旦整合到植物基 因组中，就会表现出孟德尔遗传特性，在后代中长期稳定表 达，且插入后不再移动，便于保存。早期研究认为，T-DNA在 基因组中的整合是一个随机过程，没有明显的偏爱性。以 T-DNA作为插入元件，不但能破坏插入位点基因的功能，而 且能通过插入产生的功能缺失突变体的表型及生化特征的 变化，为该基因的研究提供有用的线索。由于插入的T-DNA 序列是已知的，因此可以通过已知的外源基因序列，利用反 向PCR、TAIL-PCR.质粒挽救等方法对突变基因进行克隆和 序列分析，并对比突变的表型研究基因的功能。还可以利用 扩增出的插入位点的侧翼序列，建立侧翼序列数据库，对基 因进行更全面的分析。由此可见，T-DNA插入标签技术已成 为发现新基因、鉴定基因功能的一种重要手段。 T—DNA标签的应用 2.1大规模的植物基因功能分析 大规模的植物基因功能分析目前使用最多的是插入突 变的策略。由于农杆菌介导的T-DNA转化方法具有高效、重 复性好、简便易行和表达稳定等优点[8],而且技术已经非 常成熟，大多数植物都可以使用。此外T—DNA插入随机比, 插入的位点可以贯穿整个基因组，甚至达到饱和，尤其像拟 南芥这样的基因组很小的植物几乎可以标签到所有的基因。 因此使用T-DNA作为插入突变源进行突变体的筛选并进行 基因功能的研究在许多植物中应用并取得成功。现在拟南芥 已经有几个大规模的T—DNA插入突变体库供人们进行研究, 美国Salk基因组分析实验中心的Salk T—DNA库就是其中 之一。这些大规模的T—DNA插入库为拟南芥基因功能的进 一步研究提供了有利的工具。 2.2时空特异性启动子和表达基因的分离 如果在插入T-DNA的一端安置一个报告基因，该报告 基因没有启动子或只带有弱小的启动子，本身不表达或表达 量极低。当这样的结构整合到宿主基因组时，如果报告基因 位于内源启动子之下或者增强子附近，或者与内源的基因进 行融合就被激活表达，并反映出正常内源基因的表达模式。 利用该项技术(trapping vector)可以较方便地分离到一 些特异性启动子和特异时空表达的基因，而不必一定要产生 突变表型。这种方法已经被成功地应用于植物启动子和基因 的克隆中。 Puzio利用启动子标签法标记到一个与线虫取食有关 的基因pyk20,对该基因在各种外源激素处理和逆境胁迫反 应中的基因表达模式进行研究发现，生长素、细胞分裂素和 线虫取食处理植物可提高该基因的转录水平，而温度胁迫和 外源ABA处理降低该基因的转录水平，分析携带gus基因的 转基因系和野生型的序列，结果显示外源T-DNA插入到了 该基因的启动子处。 2.3 T—DNA插入突变体库及侧翼序列库的构建 T—DNA插入突变最大的用处是构建突变体库，在此基础 上构建侧翼序列库；目前在拟南芥中已经建立了接近饱和的 T—DNA插入突变体库，该突变体库包含超过225000个独立 的T—DNA插入株系，在预测的29454个基因中有21700个 基因发生了插入突变［11］。含T?DNA激活标签的拟南芥群 体已经获得，并且在这些群体中已经获得大量的异常突变体 和被标记基因。Sessiens等采用Ta订一PCR的方法分离了拟 南芥插入突变体库85108条T—DNA侧翼序列。结果表明， 平均约1000个拟南芥激活标签转化子能发现一个形态学突 变。水稻中已建立了具有一定规模的突变体库，但远没有达 到饱和的程度。水稻上大约获得了 47932个T—DNA插入株 系和3290个水稻激活标签转化