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巨噬细胞在混合嵌合体诱导异种免疫耐受中作用实验探究 ［摘要］目的研究巨噬细胞在建立非协调性异种 混合嵌合体中的作用及混合嵌合体的形成对受体的免疫功 能影响，探讨异种免疫耐受的机制。方法将非清髓性的预 处理SD大鼠（受体）30只随机分成3组，A组（仅输注豚 鼠BMC）； B组（豚鼠BMC移植组+空脂质体移植组）；C组（豚 鼠BMC移植组+包裹clodronate脂质体移植组）。观察指标: 大鼠肝脾CD68、嵌合体嵌合率、大鼠外周血CD3+T细胞、CD4+T 细胞和CD8+T检测、单向混合淋巴细胞反应。结果 注射包 裹clodronate脂质体后24h受体大鼠肝脾（红髓及边缘带） 中巨噬细胞消失，21d后与正常对照相比无差异。BMC移植 后24h内各时间点，C组大鼠外周血中豚鼠细胞比例均高于 A、B组；24h时大鼠脾、骨髓中豚鼠细胞比例，C组亦明显 高于A、B两组；比较21d及35d嵌合水平，C组明显高于A、 B两组。21d时CD3+、CD4+和CD8+T细胞比例均下降，各组 CD4/CD8比值与对照组相比无差异。MLR显示耐受大鼠的免 疫应答反应性降低，C组较其他组比最低。结论 增加了供 体BMC在受体体内的存活，从而提高嵌合水平，获得了更高 水平的免疫抑制。 ［关键词］巨噬细胞；嵌合体；免疫耐受；骨髓移植 ［中图分类号］R392. 4 ［文献标识码］A ［文章编号］ 2095-0616 (2013) 18-22-05 目前，由于同种器官匮乏，器官移植的数量受到限制， 异种移植是器官移植目前的重要研究方向之一。迟发性异种 排斥反应(DXR)成为了异种器官移植的主要障碍［1-2］ o研 究表明T细胞在迟发性异种排斥反应(DXR)中起重要作用， 特别是CD4+T细胞介导异种细胞排斥反应尤为重要［3-4］ o 诱导免疫耐受是抑制细胞免疫反应的最理想方法。而混合性 嵌合是目前比较有前景的诱导异种免疫耐受的策略之一 ［5］。在同种移植和协调性异种移植领域，利用混合嵌合体 可诱导出供者特异性的免疫耐受［6］。但在非协调性异种移 植供受体间，利用相同的方法却不能获得免疫耐受，其中原 因之一就是供者骨髓细胞在受体体内迅速消失而不能形成 持续稳定的嵌合体。有研究发现在比较猪-SCID/N0D小鼠(巨 噬细胞功能缺陷)及猪-SCID小鼠嵌合体模型发现，前者的 嵌合状态维持明显长于后者［7］。本研究在豚鼠到大鼠实验 动物模型中，利用脂质体包裹clodronate清除受体巨噬细 胞后，采用非清髓性的预处理方案诱导建立混合嵌合体，研 究巨噬细胞在建立非协调性异种混合嵌合体中的作用。 1材料与方法 1. 1实验动物及分组 供体选用健康三色豚鼠，雌雄不限，受体选用健康SD 雌性大鼠，体重250?300g,实验动物均由苏州大学实验动 物中心提供，实验动物许可证号：SYXK （苏）2002-0037o 取7d前开始饮红霉素（250mg/L）和庆大霉素（320mg/L） 水清洁级雌性SD大鼠，（D-0）接受60Coy射线（剂量率 0. 5Gy/min,总剂量5. OGy）全身照射，照射后4h内经后肢 隐静脉输注2X108/mL豚鼠BMC的细胞悬液0. 8mL （24h实 验组大鼠输注经CFSE标记的豚鼠BMC细胞悬液），2d （D-2） 后经环磷酰胺预处理（腹腔内注射CTX, 50mg/kg）,实验动 物随机分为3组，每组10例（各组5例预处理后24h处死）: A组（豚鼠BMC移植组）：仅行豚鼠BMC移植；B组（豚鼠BMC 移植组+空脂质体移植组）：BMC移植前3d经后肢隐静脉输注 不含clodronate空脂质体（每天2次，每次ImL）,余同A 组；C组（豚鼠BMC移植组+包裹clodronate脂质体移植组）: BMC移植前3d经后肢隐静脉输注含clodronate脂质体共 120mg/kg （每天2次），余同A组。 1.2豚鼠骨髓细胞制备 将豚鼠颈椎脱臼处死后，置于75%酒精中浸泡15min, 无菌条件下取股、胫骨，用RPMI 1640冲洗骨髓腔，反复吹 打，分散细胞，200目钢筛过滤制成单细胞悬液，加红细胞 裂解液裂解红细胞后PBS液洗2次，以RPMI 1640调整细胞 浓度为2X108个/mL备用，台盼兰染色法判定细胞活率＞90%。 1. 3脂质体包裹Clodronate制备 脂质体的制备采用反相蒸发技术，即70. 9mg磷酸卵磷 脂、10. 8mg胆固醇溶于10mL氯仿溶液中，同时加入1. 8mg/mL p-aminopheny 1 a-D-mannopyranoside 甲醇溶液 2mL,形成月旨 质，加入 10mL clodronate (10mg/mL) PBS 溶液，于 56°C超 声水浴lOmin,从而形成水包油乳剂，进而于56°C旋转